SOLARBIO/索莱宝 品牌
生产厂家厂商性质
北京市所在地
酮体含量检测试剂盒（血清、血浆、尿液等）说明书
紫外分光光度法
货号：BC5060
规格：50T/48S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一A液 | 液体55mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一B液 | 液体55mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二A液 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
试剂二B液 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×3支 | -20℃保存 |
标准品1 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
标准品2 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二A液：临用前取一支加入1.2mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃可保存3周。避免反复冻融；
2、 试剂二B液：临用前取一支加入600μL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃可保存3周。避免反复冻融；
3、 试剂三：临用前取一支加入400μL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存，可以保存3周。避免反复冻融；
4、 标准品1：8mg 3-羟基丁酸钠。临用前加入0.98mL蒸馏水，充分溶解，即8mg/mL 3-羟基丁酸钠标准溶液，2-8℃可以保存4周。临用前根据试验所需量用蒸馏水稀释成0.2mg/mL标准溶液待用，即为标准溶液1；
5、 标准品2：8mg乙酰乙酸锂。临用前加入0.95mL蒸馏水，充分溶解，即8mg/mL乙酰乙酸锂标准溶液，-20℃可以保存4周。临用前根据试验所需量用蒸馏水稀释成0.05mg/mL标准溶液待用，即标准溶液2；
6、 BOH工作液配制：临用前根据试验所需量将试剂一A液、试剂二A液 、试剂三按照850μL:40μL:10μL（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混匀，置于37℃保温15min（此步骤不可省略），现用现配，工作液在4h内用完；
7、 AcAc工作液配制：临用前根据试验所需量将试剂一B液、试剂二B液、试剂三按照870μL:20μL:10μL（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混匀，置于37℃保温15min（此步骤不可省略），现用现配，工作液在4h内用完。
产品说明：
酮体是肝脏脂肪酸氧化分解的中间产物乙酰乙酸（AcAc）、β-羟丁酸（BOH）及丙 酮三者统称。酮体中丙 酮的生成量相当小，生成后即被吸收。乙酰乙酸和β-羟丁酸则经血流进入肝外组织，在此被氧化，经柠檬酸循环提供更多能量给那些组织使用，例如骨、心肌和肾皮质。
在pH 7.0和37℃条件下，BOH在β-羟丁酸脱氢酶（HBDH）催化下脱氢生成乙酞乙酸，同时NAD+被还原成NADH；在pH 8.8和37℃条件下，AcAc被HBDH还原为3-羟基丁酸酯或脱羧生成丙 酮，同时NADH被氧化成NAD+，NADH在340nm波长下有特征吸收峰，通过检测在340nm波长下的吸光值变化可以计算出BOH和AcAc的含量，从而计算出样本中酮体的含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、可调式移液器、水浴锅/恒温培养箱、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
血清（浆）、尿液等液体样本：直接测定。（若有浑浊可以离心取上清后测定）
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。
2、 BOH含量测定：
试剂名称（μL） | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 100 | ||
标准溶液1 | 100 | ||
蒸馏水 | 100 | ||
BOH工作液 | 900 | 900 | 900 |
将上述溶液依次加入适1mL石英比色皿中，充分混匀20s，记录340nm处20s时吸光值ABOH样本1、ABOH标准1、ABOH空白1，37℃水浴锅或者培养箱反应5min，反应后拿出迅速擦干测定5min20s时吸光值ABOH样本2、ABOH标准2、ABOH空白2。计算ΔABOH样本=ABOH样本2-ABOH样本1，ΔABOH标准=ABOH标准2-ABOH标准1，ΔABOH空白=ABOH空白2-ABOH空白1。 空白管和标准管只需做1-2次。 | |||
3、 AcAc含量测定：
试剂名称（μL） | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 100 | ||
标准溶液2 | 100 | ||
蒸馏水 | 100 | ||
AcAc工作液 | 900 | 900 | 900 |
将上述溶液依次加入1mL石英比色皿中，充分混匀20s，记录340nm处20s时吸光值AAcAc样本1、AAcAc标准1、AAcAc空白1，37℃水浴锅或者培养箱反应5min，反应后拿出迅速擦干测定5min20s时吸光值AAcAc样本2、AAcAc标准2、AAcAc空白2。计算ΔAAcAc样本=AAcAc样本1-AAcAc样本2，ΔAAcAc标准=AAcAc标准1-AAcAc标准2，ΔAAcAc空白=AAcAc空白1-AAcAc空白2。 空白管和标准管只需做1-2次。 | |||
三、酮体含量计算
1、 BOH计算公式
BOH含量（μmol/mL）=(ΔABOH样本-ΔABOH空白)÷(ΔABOH标准-ΔABOH空白)×CBOH÷126.09×1000
=1.586×(ΔABOH样本-ΔABOH空白)÷(ΔABOH标准-ΔABOH空白)
2、 AcAc计算公式
AcAc含量（μmol/mL）=(ΔAAcAc样本-ΔAAcAc空白)÷(ΔAAcAc标准-ΔAAcAc空白)×CAcAc÷108.02×1000
=0.463×(ΔAAcAc样本-ΔAAcAc空白)÷(ΔAAcAc标准-ΔAAcAc空白)
3、 酮体计算公式
酮体含量（μmol/mL）= BOH含量+ AcAc含量
CBOH：BOH标准溶液1浓度，0.2mg/mL；CAcAc：AcAc标准溶液2浓度，0.05mg/mL；126.09：3-羟基丁酸钠的分子量，126.09mg/mmol；108.02：乙酰乙酸锂的分子量，108.02mg/mmol；1000：单位换算系数，1mmol= 1000μmol。
注意事项：
1. 如果测定初始吸光值＞1.5或ΔA＞0.2，建议将样本用蒸馏水稀释后再测定。计算公式中乘上稀释倍数；
2. 如果ΔA接近空白值，建议加大样本量，同时保证反应体系总体积不变，相应减少工作液加样量后测定。例如，若增大样本量为200μL，则工作液调整为800μL。标准管与样本管加样体系应保持一致，计算公式不变。
实验实例：
取100μL牛血清按上述步骤进行实验，用1mL石英比色皿测定后进行计算ΔABOH样本=ABOH样本2-ABOH样本1= 0.095-0.056=0.039，ΔABOH标准=ABOH标准2-ABOH标准1=0.175-0.024=0.151，ΔABOH空白=ABOH空白2-ABOH空白1= 0.008-0.005=0.003，ΔAAcAc样本=AAcAc样本1-AAcAc样本2=0.639-0.634=0.005，ΔAAcAc标准=AAcAc标准1-AAcAc标准2= 0.586-0.447=0.139，ΔAAcAc空白=AAcAc空白1-AAcAc空白2=0.696-0.695=0.001。计算
BOH含量（μmol/mL）=1.586×(ΔABOH样本-ΔABOH空白)÷(ΔABOH标准-ΔABOH空白)=0.369μmol/mL
AcAc含量（μmol/mL）=0.463×(ΔAAcAc样本-ΔAAcAc空白)÷(ΔAAcAc标准-ΔAAcAc空白)=0.0134μmol/mL
酮体含量（μmol/mL）= BOH含量+ AcAc含量=0.383μmol/mL。
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