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乙酰乙酸（AcAc）含量检测试剂盒（WST法）说明书
可见分光光度法
货号：BC5070
规格：50T/24S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体70mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
显色液 | 液体4mL×1瓶 | -20℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前取一支加入1.5mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃可保存3周。避免反复冻融。
2、 试剂三：临用前取一支加入400μL蒸馏水（约40T），充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存，可以保存2周。避免反复冻融。
3、 标准品：8mg 乙酰乙酸锂。临用前加入950μL蒸馏水，充分溶解，即8mg/mL 乙酰乙酸锂标准溶液。-20℃分装保存4周。
4、 工作液配制：临用前根据试验所需量将试剂一、试剂二、试剂三按照850:40:10（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混匀，置于37℃保温15min（此步骤不可省略），现用现配，工作液在4h内用完。
产品说明：
乙酰乙酸(AcAc)是酮体的重要成分之一，约占正常人酮体总量20%，是脂肪酸通过氧化产生的,是一种较强的有机酸。正常含量的乙酰乙酸对人体无害，糖尿病患者由于糖的利用降低，或饥饿时由于糖的代谢障碍，大量动用脂肪，乙酰乙酸的量都会积累。乙酰乙酸即可转化成丙酮，也可以转化成β-羟丁酸。
在检测中，乙酰乙酸通过偶联酶反应产生450nm吸收峰的产物，与存在的乙酰乙酸成比例。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织样本的制备：按照质量（g）: 提取液体积(mL)为1: 5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，12000 g离心10 min，取上清，置冰上待测。
2、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000 g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）：直接测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。
2、 标准溶液配制：将8mg/mL 乙酰乙酸锂标准溶液，用蒸馏水稀释0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 mg/mL标准溶液待用。
3、 按下表步骤加样：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 |
样本 | 100 | 100 | ||
蒸馏水 | 100 | |||
标准溶液 | 100 | |||
工作液 | 900 | 900 | 900 | |
试剂一 | 900 | |||
37℃条件下反应10 min | ||||
显色液 | 50 | 50 | 50 | 50 |
37℃条件下避光反应20 min | ||||
于450 nm处测定吸光度。分别记为A测定、A对照、A空白、A标准。ΔA测定=A空白-（A测定-A对照），ΔA标准=A空白-A标准。空白管只需做1-2次。 | ||||
三、AcAc含量计算
1、 标准曲线绘制：以乙酰乙酸锂标准溶液浓度为横坐标（x，mg/mL），以ΔA标准为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程求得x（mg/mL）。
2、 计算公式
（1）按照蛋白浓度计算
AcAc含量（μmol/mg prot）=x×V样÷（V样×Cpr）÷108.02×1000=9.258x÷Cpr
（2）按照样本质量计算
AcAc含量（μmol/g 质量）=x×V样÷（W×V样÷V样总）÷108.02×1000=9.258x÷W
（3）按照细胞或细菌数量计算
AcAc含量（μmol/104 cell）=x×V样÷（细胞数量×V样÷V样总）÷108.02×1000=9.258x÷细胞数量
（4）按照血清（浆）体积计算
AcAc含量（μmol/mL）=x×V样÷V样÷108.02=9.258x
V样：反应中加入样本体积，100 μL=0.1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：细胞或细菌总数，以104计；V样总：加入提取液体积，1 mL；108.02：乙酰乙酸锂分子量，mg/mmol。
注意事项：
1、显色完成后，请在15min之内完成检测。
2、如果ΔA测定低于或超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
实验实例：
1. 取100μL 牛血清按上述步骤进行实验，用1mL玻璃比色皿测定后进行计算ΔA测定=A空白-（A测定-A对照）=1.101-（1.129-0.063）=0.035，带入标准曲线y=0.299x+0.006，计算x=0.097。计算
AcAc含量（μmol/mL）=9.258x=0.898μmol/mL
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