微生物及液体样本中甲醛脱氢酶（FDH）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC4990

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取1支加入0.25 mL蒸馏水，震荡溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周。

2、 试剂二工作液：根据试验所需用量，按照试剂二（μL）∶蒸馏水（μL）=1∶29比例配成工作液，现配现用。试剂二工作液当天配制当天用完。

3、 试剂三：临用前取1支加入1.5 mL蒸馏水，震荡使其充分溶解。用不完的试剂4℃分装保存2周。

产品说明：

甲醛脱氢酶存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中，是一种将甲醛进行转换的氧化还原酶。甲醛脱氢酶催化甲醛和 NAD⁺产生 NADH，在 340nm 处的吸光值会增加，测定340nm处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、1 mL石英比色皿、低温离心机、恒温水浴锅/培养箱、可调式移液枪、超声波细胞破碎仪、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1 mL提取液，超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔9s，总时间 3 min）；然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待测。

血清及液体样本：直接检测，若液体不澄清，可以离心后取上清测定。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30 min 以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。

2、 临用前将试剂一置于37℃预热20 min。

3、在1 mL石英比色皿中依次加入 100 μL 样本、550 μL试剂一、250 μL试剂二工作液、50 μL试剂三、50 μL试

剂四，立即充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅或者培养箱中反应5min，拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2，记录 340nm 下20s时吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2。计算ΔA=A2-A1。

三、酶活性计算

1、细菌或培养细胞中FDH活力的计算

（1）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样÷V样总×N）÷T×F =ΔA×321.54÷N×F

（2）按蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2、血清（浆）或液体样本FDH活力的计算

（1）按液体体积计算：

单位的定义：每mL液体样本中每分钟催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T×F =ΔA×321.54×F

（2）按蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

e：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V反总：酶促反应总体积，0.001L；V样总：加入提取液体积，1 mL；V样：加入样本体积，0.1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；N：细胞或细菌总数，以万计；F：稀释倍数；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹ nmol。

注意事项：

1、如果测定吸光值A＞1.5或ΔA＞0.5，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低，建议增加样本量后再进行测定。

2、试剂四有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。

实验实例：

1、 取0.1g大肠杆菌沉淀加入1 mL提取液，超声波破碎细胞（功率300W，超声3s，间隔9s，总时间 3min）；然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清按照测定步骤操作，测定后计算ΔA =A2-A1=0.297-0.039=0.258，按细菌数量计算酶活得：

FDH酶活（U/g 质量）= 321.54×ΔA÷W×F =829.57 U/g。

2、 取0.1 mL牛血清按照测定步骤操作，测定后计算ΔA=A2 -A1=0.124-0.087=0.037，按液体体积计算酶活得：

FDH酶活（U/mL）=ΔA×321.54=11.896 U/mL。

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