β-羟丁酸（β-HB）含量检测试剂盒（WST法）说明书

可见分光光度法

货号：BC5080

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取一支加入1.5mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃可保存3周。避免反复冻融。

2、 试剂三：临用前取一支加入400μL蒸馏水（约40T），充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存，可以保存2周。避免反复冻融。

3、 标准品：8mg 3-羟基丁酸钠。临用前加入980μL蒸馏水，充分溶解，即8mg/mL 3-羟基丁酸钠标准溶液。4℃保存1个月。

4、 工作液配制：临用前根据试验所需量将试剂一、试剂二、试剂三按照850:40:10（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混匀，置于37℃保温15min（此步骤不可省略），现用现配，工作液在4h内用完。

产品说明：

β-羟丁酸（β-HB），在严重酸中毒患者体内，由于酸中毒使患者体内NADH生成增加，进而促使β-羟丁酸与乙酰乙酸的比值自正常的2:1提高至16:1。β-羟丁酸在检测糖尿病酮症酸中毒诊断、治疗中有重要意义，对糖尿病的早期诊断也有重要意义。本试剂盒适用于血清、血浆、尿液等样本。

在pH8.8和37℃条件下，β-HB在β-羟丁酸脱氢酶（HBDH）催化下脱氢生成乙酞乙酸，同时NAD⁺被还原成NADH；在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH反应，产生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰。通过检测450nm下波长变化，可计算出β-HB的含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 适用样本

血清、血浆、尿液等样本，直接检测即可，若溶液有浑浊可离心后进行测定

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、 标准溶液配制：将8mg/mL 3-羟基丁酸钠标准溶液，用蒸馏水稀释至0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125mg/mL标准溶液待用。

3、 按下表步骤加样：

三、β-HB含量计算

1、 标准曲线绘制：以β-HB标准溶液浓度为横坐标（x，mg/mL），以ΔA标准为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程求得x（mg/mL）。

2、 计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

β-HB含量（μmol /mg prot）=x×V样÷（V样×Cpr）÷126.09×1000=7.931x÷Cpr

（2）按照血清（浆）体积计算

β-HB含量（μmol /mL）=x×V样÷V样÷126.09×1000=7.931x

V样：反应中加入样本体积，100 μL=0.1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；126.09：β-羟基丁酸钠分子量，mg/mmol；1000：1mmol=1000μmol。

注意事项：

1、显色完成后，请在10 min之内完成检测。

2、如果ΔA测定低于或超过标准曲线吸光值范围，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

实验实例：

1. 取100μL 牛血清按上述步骤进行实验，用1mL玻璃比色皿测定后进行计算ΔA测定=A测定-A对照=0.585- 0.057= 0.528，带入标准曲线y=0.7905x+0.0221，的x=0.640。计算

β-HB含量（μmol /mL）=7.931x=5.076 μmol /mL

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