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二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0440
规格：25T/24S、50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称/规格 | 25T | 50T | 保存条件 |
| 提取液 | 液体25 mL×1瓶 | 液体50 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 试剂一 | 液体25 mL×1瓶 | 液体50 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
| 试剂三 | 粉剂×2支 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
| 试剂四 | 粉剂×1支 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
25T溶液的配制：
试剂三：临用前取1支加入0.5mL蒸馏水充分溶解待用，振荡溶解后若出现浑浊可以离心使用；
试剂四：临用前加入1mL 蒸馏水充分溶解待用；
工作液的配制：临用前在试剂二中加入全部试剂一，充分混匀，在25℃孵育5min。
50T溶液的配制：
1、试剂三：临用前取1支加入1 mL蒸馏水充分溶解待用，振荡溶解后若出现浑浊可以离心使用；
2、试剂四：临用前加入2 mL 蒸馏水充分溶解待用；
3、工作液的配制：临用前在试剂二中加入全部试剂一，充分混匀，在25℃孵育5min。
产品说明：
1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco, EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH氧化生成NAD+；在340nm NADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，因此测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或细胞样本的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。建议选取新鲜的植物样本。
二、测定步骤
紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
按下表步骤加样：
| 试剂名称 | 测定管 | 空白管 |
| 样本（μL） | 100 | - |
| 蒸馏水（μL） | - | 100 |
| 试剂三（μL） | 35 | 35 |
| 试剂四（μL） | 35 | 35 |
| 工作液（μL） | 900 | 900 |
记录340nm处20s时吸光值A1和5min20s时的吸光值A2，计算ΔA测定=A1测定-A2测定。ΔA空白=A1空白-A2空白；ΔA =ΔA测定-ΔA空白。反应温度保持在25℃。（空白管只做1-2管）
三、Rubisco活性计算
按样本蛋白浓度计算
单位的定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T =344×ΔA÷Cpr
按样本质量计算
单位的定义：25℃中每 g组织每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T=344×ΔA÷W
按细菌或细胞数量计算
单位的定义：25℃中每1万个细菌或细胞每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=0.69×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.07×10-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
实验实例：
取0.1g植物叶片，加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.279-1.206=0.073，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.834-0.823=0.011，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.073-0.011=0.062，按样本质量计算酶活得：Rubisco活力（U/g 质量）=344×ΔA÷W=344×0.062÷0.1=213.28 U/g 质量
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