产品信息
 

产品描述
 

本产品是用于lllumina^®平台高通量测序文库浓度定量的试剂盒，提供定量所需DNA标准品，包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA//片段溶液，浓度为20 pM-0.0002 pM。本产品可搭配qPCR Master Mix（Cat#12302: 包含定量所需的qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。扩增引物根据NGS文库接头序列P5和P7设计，可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子；qPCR Master Mix是基于抗体法热启动的染料法qPCR预混液。）可对不同长度、不同GC或AT含量样本中高效、特异扩增，实现精确定量。

本试剂盒已经过严格的质量和功能检测，试剂盒所有组分均达到DNA污染控制的严格质控要求，应用于NGS文库定量精确灵敏，且批间稳定，结果重现性优异。

产品组分
 

注意：

1. 根据仪器类型选择合适的参比染料ROX。
 

2. qPCR Primer Mix 中包含一对引物，序列如下，可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。

Primer 1：5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'

Primer 2：5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'

运输与保存方法
 

冰袋运输。所有组分应-20℃保存，qPCR Master Mix与ROX避光保存，有效期6个月；如短期内反复使用，qPCR Master Mix可解冻后于4℃避光暂存，有效期3个月。

注意事项
 

一、关于操作
 

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前确保产品冻融和*混匀，短暂离心收集至管底后置于冰上备用。

3. 为保证产品品质，避免反复冻融超过30次！

4. 为避免样品交叉和气溶胶污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 试剂吸取时应保证枪头适当深入液体，排出时应确认枪头无残留。

二、关于文库稀释
 

文库需稀释至标准曲线有效Ct范围内进行定量，稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考（如NanoDrop^®，Qubit^®或Bioanalyzer）。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。

由于DNA在非缓冲环境中易降解，因此应使用缓冲稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）稀释文库，切勿使用水作为稀释液。测定时，文库应现测定现稀释，置于冰上待测，切勿使用以往配制储存的稀释后文库。

表1  DNA Standard浓度

三、污染与阴性对照（Contamination and No-template Controls）
 

1. 进行qPCR实验时，应保证良好的实验操作规范，以防对工作区域、试剂、耗材、仪器、DNA标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离，并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。

2. 反应体系配制过程中DNA Standards的加入应按照从低浓度至高浓度（DNA Standard 6至1）的顺序进行，每次移液都应更换新的枪头，以避免气溶胶污染。

3. 每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应，配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina^®平台固定序列而非qPCR引物序列，且扩增循环数较多，NTC阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生Ct属正常情况。正常情况下Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3。

四. 扩增曲线基线设置
 

因DNA Standard 1的摩尔浓度远远高于常规qPCR模板，其Ct往往非常小。而大部分qPCR仪器都默认将3-15循环设置为基线（Baseline），有时会将DNA Standard 1的Ct值误认为是测定时的噪声背景，继而影响标准曲线制作。手动设置基线（Baseline）为1-3循环可以有效避免这种情况发生。

五、文库长度矫正
 

为避免片段长度对文库定量的影响，需要在定量结果计算时，对文库长度进行矫正。根据文库荧光染料SYBR^® Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比的原则，根据以下公式进行文库浓度长度矫正。

矫正后的稀释文库浓度（pM）= [450 bp /文库平均长度（bp）] × 稀释文库的浓度（pM）

六、熔解曲线分析
 

熔解曲线在配合NTC阴性对照进行污染程度分析以及确认标准曲线大有效Ct时至关重要，推荐每次实验都进行熔解曲线采集步骤。本产品DNA Standards产生的熔解曲线呈现特征单峰。

图1  文库标准品熔解曲线

使用方法
 

一、解冻试剂
 

将Hieff NGS^® qPCR Mix，Primer Mix，DNA Standards 1-6，文库稀释液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20），ROX Dye（如需要）从冰箱中拿出，冰浴解冻。各试剂解冻后，涡旋混匀，短暂离心后置于冰上备用。

二、稀释文库
 

使用文库稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库，可额外设置3个2倍稀释梯度，如按1:1000稀释文库，可额外设置1:2000，1:4000，1:8000稀释比例，以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

三、反应体系配制
 

于反应管中配制如下体系，上下颠倒或涡旋振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

表2  qPCR反应体系

注：1）每个反应至少设置3个平行；2）推荐进行20 μL反应体系，如需进行10 μL反应，则将体系各组分等比减少；3）*在阴性对照反应管中加入ddH₂O；在样品反应管中加入稀释后的文库；在标准曲线反应管中加入DNA Standards；4）根据仪器选择合适的ROX，推荐使用量为0.5 μL。

四、qPCR运行程序
 

将反应管置于qPCR仪中，按下述条件设置qPCR反应程序，并运行（熔解曲线可根据仪器默认即可）。

表3  qPCR程序

注：*当文库平均长度>700 bp时，建议延伸时间延长至90 sec。

五、数据分析
 

1. 标准曲线制作
 

1）根据复孔间Ct差异≤0.2的原则，对DNA Standards原始Ct进行过滤，并计算平均Ct。

2）使用有效范围内的Ct（作为纵坐标）和Log[pM]（作为横坐标）绘制标准曲线。参照NTC阴性对照Ct确认标准曲线Ct有效范围。

如Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3，则大有效Ct为Ct (DNA Standard 6)，应使用DNA Standard 1-6所产生的Ct绘制标准曲线；

如Ct (DNA Standard 6) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5) + 3，则大有效Ct为Ct (DNA Standard 5)，应使用DNA Standard 1-5所产生的Ct绘制标准曲线；

如Ct (DNA Standard 5) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 4) + 3，则大有效Ct为Ct (DNA Standard 4)，应使用DNA Standard 1-4所产生的Ct绘制标准曲线；

基于定量准确性考虑，请至少使用4个Ct (DNA Standards)绘制标准曲线。如Ct (DNA Standard 4) + 3 > Ct (NTC)，提示定量体系存在严重污染，需更换体系中所有组分后重复试验。

3）绘制的标准曲线相关系数R²应不低于0.99，斜率应位于-3.1至-3.6之间（表示扩增效率位于90%-110%之间）。如标准曲线参数不佳，应重复试验。

2. 文库浓度计算
 

稀释文库的Ct只有位于标准曲线有效Ct范围之内才可用于浓度计算，同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度（nM）：

原始文库浓度（nM）= [450 bp /文库平均长度（bp）] × 稀释文库的浓度（pM）× 稀释倍数/1000

六、使用案例
 

用Hieff NGS^® DNA Library Quantification Kit for Illumina^®定量嗜盐杆菌基因组DNA文库，文库GC含量为70%，长度450 bp。将文库稀释10000倍上机检测，结果如下图所示。根据标曲及公式，文库终浓度=4.37 pM × 稀释倍数10000=43.7 nM。

图2  文库qPCR精确定量

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