Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for

12302ES05Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for

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具体成交价以合同协议为准
2022-02-10 10:18:36
1264
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生物产业
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翌圣生物科技(上海)股份有限公司

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产品简介

本产品是用于lllumina®平台高通量测序文库浓度定量的试剂盒,提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。其中,DNA标准品包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA溶液,浓度为20 pM-0.0002 pM;扩增引物对根据NGS文库接头序列P5和P7设计,可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子。

详细介绍

Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®

 

产品信息

 

产品名称

产品编号

规格

储存

价格(元)

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

12302ES05

500 T

-20℃

1526.00

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard 1-6

12307ES09

6×96 μL

-20℃

2126.00

 

产品描述

本产品是用于lllumina®平台高通量测序文库浓度定量的试剂盒,提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix定量扩增引物和参比染料ROX。其中,DNA标准品包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA///片段溶液,浓度为20 pM-0.0002 pM;扩增引物对根据NGS文库接头序列P5和P7设计,可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子;qPCR Master Mix是基于抗体法热启动的染料法qPCR预混液,可在不同长度、不同GC或AT含量样本中高效、特异扩增,实现精确定量。

本试剂盒已经过严格的质量和功能检测,试剂盒所有组分均达到DNA污染控制的严格质控要求,应用于NGS文库定量精确灵敏,且批间稳定,结果重现性优异。

 

产品组分

组分编号

组分名称

规格

12302ES05

12307ES09

12302-A

Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix (2×)

5×1 mL

--

12302-B

qPCR Primer Mix

600 μL

--

12302-C

50×Low Rox

200 μL

--

12302-D

50×High Rox

200 μL

--

-

DNA Standards 1-6

6×96 μL

--

 

注意:

1. 根据仪器类型选择合适的参比染料ROX。

类别

机型

不添加ROX

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Cepheid SmartCycler®; Eppendorf Mastercycler®ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene®Q, Rotor-Gene®3000, Rotor-Gene®6000; Roche Applied Science LightCyclerTM480; Thermo Scientific PikoReal Cycler.

添加50×High Rox

Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOnePlus™.

添加50×Low Rox

Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3005P™, MX3000P™

2. qPCR Primer Mix 中包含一对引物,序列如下,可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。

Primer 1:5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'

Primer 2:5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'

 

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分应-20保存,qPCR Master Mix与ROX避光保存,有效期6个月;如短期内反复使用,qPCR Master Mix可解冻后于4℃避光暂存,有效期3个月。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前确保产品冻融和*混匀,短暂离心收集至管底后置于冰上备用。

3. 为保证产品品质,避免反复冻融超过30次!

4. 为避免样品交叉和气溶胶污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 试剂吸取时应保证枪头适当深入液体,排出时应确认枪头无残留。

二、关于文库稀释

文库需稀释至标准曲线有效Ct范围内进行定量,稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考(如NanoDrop®,Qubit®Bioanalyzer)。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。

由于DNA在非缓冲环境中易降解,因此应使用缓冲稀释液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20)稀释文库,切勿使用水作为稀释液。测定时,文库应现测定现稀释,置于冰上待测,切勿使用以往配制的储存的稀释后文库。

表1  DNA Standard浓度

DNA Standard

摩尔浓度

质量浓度

拷贝数浓度

Std 1

20 pM

5.5 pg/μL

12×106 copies/μL

Std 2

2 pM

0.55 pg/μL

12×105 copies/μL

Std 3

0.2 pM

0.055 pg/μL

12×104 copies/μL

Std 4

0.02 pM

0.0055 pg/μL

12×103 copies/μL

Std 5

0.002 pM

0.00055 pg/μL

12×102 copies/μL

Std 6

0.0002 pM

0.000055 pg/μL

12×101 copies/μL

三、污染与阴性对照(Contamination and No-template Controls)

1. 进行qPCR实验时,应保证良好的实验操作规范以防对工作区域试剂耗材仪器、DNA标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离,并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。

2. 反应体系配制过程中DNA Standards的加入应按照从低浓度至高浓度(DNA Standard 6至1)的顺序进行,每次移液都应更换新的枪头,以避免气溶胶污染。

3. 每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应,配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina®平台固定序列而非qPCR引物序列,且扩增循环数较多,NTC阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生Ct属正常情况。正常情况下Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3。

四. 扩增曲线基线设置

因DNA Standard 1的摩尔浓度远远高于常规qPCR模板,其Ct往往非常小。而大部分qPCR仪器都默认将3-15循环设置为基线(Baseline),有时会将DNA Standard 1的Ct值误认为是测定时的噪声背景,继而影响标准曲线制作。手动设置基线(Baseline)为1-3循环可以有效避免这种情况发生。

五、文库长度矫正

为避免片段长度对文库定量的影响,需要在定量结果计算时,对文库长度进行矫正。根据文库荧光染料SYBR® Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比的原则,根据以下公式进行文库浓度长度矫正。

矫正后的稀释文库浓度(pM)= [450 bp /文库平均长度(bp)] × 稀释文库的浓度(pM)

六、融解曲线分析

融解曲线在配合NTC阴性对照进行污染程度分析以及确认标准曲线大有效Ct时至关重要,推荐每次实验都进行融解曲线采集步骤。本产品,DNA Standards产生的熔解曲线呈现特征单峰。

 

图1  文库标准品熔解曲线

 

使用方法

一、解冻试剂

将Hieff NGS® qPCR Mix,Primer Mix,DNA Standards 1-6文库稀释液10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20),ROX Dye(如需要)从冰箱中拿出,冰浴解冻。各试剂解冻后,涡旋混匀,短暂离心后置于冰上备用。

二、稀释文库

使用文库稀释液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20)对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库,可额外设置3个2倍稀释梯度,如按1:1000稀释文库,可额外设置1:2000,1:4000,1:8000稀释比例,以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

三、反应体系配制

于反应管中配制如下体系上下颠倒或涡旋振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

表2  qPCR反应体系

名称

体积

Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix(2×)

10 μL

qPCR Primer Mix

1 μL

Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O*

2 μL

ddH2O

7 μL

Total

20 μL

注:1)每个反应至少设置3个平行;2)推荐进行20 μL反应体系,如需进行10 μL反应,则将体系各组分等比减少;3)*在阴性对照反应管中加入ddH2O;在样品反应管中加入稀释后的文库;在标准曲线反应管中加入DNA Standards;4)根据机型添加合适ROX,推荐加入量0.4 μL。

四、qPCR运行程序

将反应管置于qPCR仪中,按下述条件设置qPCR反应程序并运行(熔解曲线可根据仪器默认即可)。

表3  qPCR程序

步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1 cycle

循环反应

95℃

10 sec

40 cycles

60℃

45 sec*

熔解曲线

95℃

15 sec

1 cycle

60℃

60 sec

95℃

15 sec

注:*当文库平均长度>700 bp时建议延伸时间延长至90 sec。

五、数据分析

1. 标准曲线制作

1)根据复孔间Ct差异≤0.2的原则,对DNA Standards原始Ct进行过滤,并计算平均Ct。

2)使用有效范围内的Ct(作为纵坐标)和Log[pM](作为横坐标)绘制标准曲线。参照NTC阴性对照Ct确认标准曲线Ct有效范围。

如Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3,则大有效Ct为Ct (DNA Standard 6),应使用DNA Standard 1-6所产生的Ct绘制标准曲线;

如Ct (DNA Standard 6) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5) + 3,则大有效Ct为Ct (DNA Standard 5),应使用DNA Standard 1-5所产生的Ct绘制标准曲线;

如Ct (DNA Standard 5) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 4) + 3,则大有效Ct为Ct (DNA Standard 4),应使用DNA Standard 1-4所产生的Ct绘制标准曲线;

基于定量准确性考虑,请至少使用4个Ct (DNA Standards)绘制标准曲线。如Ct (DNA Standard 4) + 3 > Ct (NTC),提示定量体系存在严重污染,需更换体系中所有组分后重复试验。

3)绘制的标准曲线相关系数R2应不低于0.99,斜率应位于-3.1至-3.6之间表示扩增效率位于90%-110%之间)。如标准曲线参数不佳,应重复试验。

2. 文库浓度计算

稀释文库的Ct只有位于标准曲线有效Ct范围之内才可用于浓度计算,同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度(nM):

原始文库浓度(nM)= [450 bp /文库平均长度(bp)] × 稀释文库的浓度(pM)× 稀释倍数/1000

六、使用案例

用Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜盐杆菌基因组DNA文库,文库GC含量为70%,长度450 bp。将文库稀释10000倍上机检测,结果如下图所示。根据标曲及公式,文库终浓度=4.37 pM × 稀释倍数10000=43.7 nM。

 

图2  文库qPCR精确定量

常见问题

问题

可能原因与解决方法

扩增效率不在90%-110%

1. 如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,且计算扩增效率超过100%,提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。

2. 不恰当的基线基线(Baseline)设置。手动调整基线(Baseline)为1-3循环。

3. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。

相关系数R2 < 0.99

1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。

2. 仪器相关问题,确保仪器与ROX匹配使用。

标曲扩增曲线分布不均一

1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,提示反应体系有污染。根据NTC

阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。

2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1,提示基线基线(Baseline)设置不当。手动调整基线基线(Baseline)为1-3。

3. DNA Standards之间的ΔCt > 3.6,提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并*混匀;确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。

4. 长时间强光照射会导致qPCR Master Mix荧光值下降,进而造成ΔCt > 3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。

复孔重复性差

1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。

2. 仪器相关问题,确保仪器与ROX匹配使用。

文库稀释液ΔCt不在合理范围(如2倍稀释文库ΔCt为0.9-1.1)

1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。

2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。

3. 文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用。

文库各稀释度计算的初始文库浓度差异超过10%

1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。

2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。

3. 文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用。

稀释文库Ct值不在标曲Ct的有效范围

1. 使用有效范围内的Ct值计算文库浓度。当Ct (稀释文库) < Ct (DNA Standard 1),提示文库稀释度不够,应提高文库稀释倍数重复实验。

2. Ct (稀释文库) > Ct (DNA Standard 6),提示文库稀释度过高,应减少稀释倍数重复实验。

3. 推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库,可额外设置3个2倍稀释梯度,如按1:1000稀释文库,可额外设置1:2000,1:4000,1:8000稀释比例,以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

DNA Standard 1扩增曲线异常

不恰当的基线基线(Baseline)设置。手动调整基线(Baseline)为1-3循环。

DNA Standards有扩增,而文库没有或Ct很大

1. 文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。

2. 稀释度过高。减少稀释倍数,重复实验。

3. 文库降解。文库应现用现稀释。

 

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