12302ES05Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for
Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
Hieff NGS™ DNA分选磁珠
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¥3155Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格(元) |
Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix | 12302ES05 | 500 T | -20℃ | 1526.00 |
Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard 1-6 | 12307ES09 | 6×96 μL | -20℃ | 2126.00 |
产品描述
本产品是用于lllumina®平台高通量测序文库浓度定量的试剂盒,提供定量所需的DNA标准品、qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料ROX。其中,DNA标准品包含经梯度稀释的六份450 bp的双链DNA///片段溶液,浓度为20 pM-0.0002 pM;扩增引物对根据NGS文库接头序列P5和P7设计,可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子;qPCR Master Mix是基于抗体法热启动的染料法qPCR预混液,可在不同长度、不同GC或AT含量样本中高效、特异扩增,实现精确定量。
本试剂盒已经过严格的质量和功能检测,试剂盒所有组分均达到DNA污染控制的严格质控要求,应用于NGS文库定量精确灵敏,且批间稳定,结果重现性优异。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 规格 | 12302ES05 | 12307ES09 |
12302-A | Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix (2×) | 5×1 mL | √ | -- |
12302-B | qPCR Primer Mix | 600 μL | √ | -- |
12302-C | 50×Low Rox | 200 μL | √ | -- |
12302-D | 50×High Rox | 200 μL | √ | -- |
- | DNA Standards 1-6 | 6×96 μL | -- | √ |
注意:
1. 根据仪器类型选择合适的参比染料ROX。
类别 | 机型 |
不添加ROX | Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™; Cepheid SmartCycler®; Eppendorf Mastercycler®ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene®Q, Rotor-Gene®3000, Rotor-Gene®6000; Roche Applied Science LightCyclerTM480; Thermo Scientific PikoReal Cycler. |
添加50×High Rox | Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne™, StepOnePlus™. |
添加50×Low Rox | Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA™7; Stratagene MX4000™, MX3005P™, MX3000P™ |
2. qPCR Primer Mix 中包含一对引物,序列如下,可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。
Primer 1:5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'
Primer 2:5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'
运输与保存方法
冰袋运输。所有组分应-20℃保存,qPCR Master Mix与ROX避光保存,有效期6个月;如短期内反复使用,qPCR Master Mix可解冻后于4℃避光暂存,有效期3个月。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前确保产品冻融和*混匀,短暂离心收集至管底后置于冰上备用。
3. 为保证产品品质,避免反复冻融超过30次!
4. 为避免样品交叉和气溶胶污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。
5. 试剂吸取时应保证枪头适当深入液体,排出时应确认枪头无残留。
二、关于文库稀释
文库需稀释至标准曲线有效Ct范围内进行定量,稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考(如NanoDrop®,Qubit®或Bioanalyzer)。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。
由于DNA在非缓冲环境中易降解,因此应使用缓冲稀释液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20)稀释文库,切勿使用水作为稀释液。测定时,文库应现测定现稀释,置于冰上待测,切勿使用以往配制的储存的稀释后文库。
表1 DNA Standard浓度
DNA Standard | 摩尔浓度 | 质量浓度 | 拷贝数浓度 |
Std 1 | 20 pM | 5.5 pg/μL | 12×106 copies/μL |
Std 2 | 2 pM | 0.55 pg/μL | 12×105 copies/μL |
Std 3 | 0.2 pM | 0.055 pg/μL | 12×104 copies/μL |
Std 4 | 0.02 pM | 0.0055 pg/μL | 12×103 copies/μL |
Std 5 | 0.002 pM | 0.00055 pg/μL | 12×102 copies/μL |
Std 6 | 0.0002 pM | 0.000055 pg/μL | 12×101 copies/μL |
三、污染与阴性对照(Contamination and No-template Controls)
1. 进行qPCR实验时,应保证良好的实验操作规范,以防对工作区域、试剂、耗材、仪器、DNA标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离,并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。
2. 反应体系配制过程中DNA Standards的加入应按照从低浓度至高浓度(DNA Standard 6至1)的顺序进行,每次移液都应更换新的枪头,以避免气溶胶污染。
3. 每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应,配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina®平台固定序列而非qPCR引物序列,且扩增循环数较多,NTC阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生Ct属正常情况。正常情况下Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3。
四. 扩增曲线基线设置
因DNA Standard 1的摩尔浓度远远高于常规qPCR模板,其Ct往往非常小。而大部分qPCR仪器都默认将3-15循环设置为基线(Baseline),有时会将DNA Standard 1的Ct值误认为是测定时的噪声背景,继而影响标准曲线制作。手动设置基线(Baseline)为1-3循环可以有效避免这种情况发生。
五、文库长度矫正
为避免片段长度对文库定量的影响,需要在定量结果计算时,对文库长度进行矫正。根据文库荧光染料SYBR® Green I结合DNA后产生的荧光强度与DNA分子量成正比的原则,根据以下公式进行文库浓度长度矫正。
矫正后的稀释文库浓度(pM)= [450 bp /文库平均长度(bp)] × 稀释文库的浓度(pM)
六、融解曲线分析
融解曲线在配合NTC阴性对照进行污染程度分析以及确认标准曲线大有效Ct时至关重要,推荐每次实验都进行融解曲线采集步骤。本产品,DNA Standards产生的熔解曲线呈现特征单峰。
图1 文库标准品熔解曲线
使用方法
一、解冻试剂
将Hieff NGS® qPCR Mix,Primer Mix,DNA Standards 1-6,文库稀释液(10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20),ROX Dye(如需要)从冰箱中拿出,冰浴解冻。各试剂解冻后,涡旋混匀,短暂离心后置于冰上备用。
二、稀释文库
使用文库稀释液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20)对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库,可额外设置3个2倍稀释梯度,如按1:1000稀释文库,可额外设置1:2000,1:4000,1:8000稀释比例,以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。
三、反应体系配制
于反应管中配制如下体系,上下颠倒或涡旋振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
表2 qPCR反应体系
名称 | 体积 |
Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix(2×) | 10 μL |
qPCR Primer Mix | 1 μL |
Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O* | 2 μL |
ddH2O | 7 μL |
Total | 20 μL |
注:1)每个反应至少设置3个平行;2)推荐进行20 μL反应体系,如需进行10 μL反应,则将体系各组分等比减少;3)*在阴性对照反应管中加入ddH2O;在样品反应管中加入稀释后的文库;在标准曲线反应管中加入DNA Standards;4)根据机型添加合适ROX,推荐加入量0.4 μL。
四、qPCR运行程序
将反应管置于qPCR仪中,按下述条件设置qPCR反应程序,并运行(熔解曲线可根据仪器默认即可)。
表3 qPCR程序
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 5 min | 1 cycle |
循环反应 | 95℃ | 10 sec | 40 cycles |
60℃ | 45 sec* | ||
熔解曲线 | 95℃ | 15 sec | 1 cycle |
60℃ | 60 sec | ||
95℃ | 15 sec |
注:*当文库平均长度>700 bp时,建议延伸时间延长至90 sec。
五、数据分析
1. 标准曲线制作
1)根据复孔间Ct差异≤0.2的原则,对DNA Standards原始Ct进行过滤,并计算平均Ct。
2)使用有效范围内的Ct(作为纵坐标)和Log[pM](作为横坐标)绘制标准曲线。参照NTC阴性对照Ct确认标准曲线Ct有效范围。
如Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 6) + 3,则大有效Ct为Ct (DNA Standard 6),应使用DNA Standard 1-6所产生的Ct绘制标准曲线;
如Ct (DNA Standard 6) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5) + 3,则大有效Ct为Ct (DNA Standard 5),应使用DNA Standard 1-5所产生的Ct绘制标准曲线;
如Ct (DNA Standard 5) + 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 4) + 3,则大有效Ct为Ct (DNA Standard 4),应使用DNA Standard 1-4所产生的Ct绘制标准曲线;
基于定量准确性考虑,请至少使用4个Ct (DNA Standards)绘制标准曲线。如Ct (DNA Standard 4) + 3 > Ct (NTC),提示定量体系存在严重污染,需更换体系中所有组分后重复试验。
3)绘制的标准曲线相关系数R2应不低于0.99,斜率应位于-3.1至-3.6之间(表示扩增效率位于90%-110%之间)。如标准曲线参数不佳,应重复试验。
2. 文库浓度计算
稀释文库的Ct只有位于标准曲线有效Ct范围之内才可用于浓度计算,同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度(nM):
原始文库浓度(nM)= [450 bp /文库平均长度(bp)] × 稀释文库的浓度(pM)× 稀释倍数/1000
六、使用案例
用Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜盐杆菌基因组DNA文库,文库GC含量为70%,长度450 bp。将文库稀释10000倍上机检测,结果如下图所示。根据标曲及公式,文库终浓度=4.37 pM × 稀释倍数10000=43.7 nM。
图2 文库qPCR精确定量
常见问题
问题 | 可能原因与解决方法 |
扩增效率不在90%-110% | 1. 如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,且计算扩增效率超过100%,提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。 2. 不恰当的基线基线(Baseline)设置。手动调整基线(Baseline)为1-3循环。 3. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。 |
相关系数R2 < 0.99 | 1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。 2. 仪器相关问题,确保仪器与ROX匹配使用。 |
标曲扩增曲线分布不均一 | 1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,提示反应体系有污染。根据NTC 阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。 2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1,提示基线基线(Baseline)设置不当。手动调整基线基线(Baseline)为1-3。 3. DNA Standards之间的ΔCt > 3.6,提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并*混匀;确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。 4. 长时间强光照射会导致qPCR Master Mix荧光值下降,进而造成ΔCt > 3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。 |
复孔重复性差 | 1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。 2. 仪器相关问题,确保仪器与ROX匹配使用。 |
文库稀释液ΔCt不在合理范围(如2倍稀释文库,ΔCt为0.9-1.1) | 1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。 2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。 3. 文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用。 |
文库各稀释度计算的初始文库浓度差异超过10% | 1. 移液精确度差,重复实验,确保所有试剂使用前*溶解并混匀。 2. 文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差。 3. 文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用。 |
稀释文库Ct值不在标曲Ct的有效范围 | 1. 使用有效范围内的Ct值计算文库浓度。当Ct (稀释文库) < Ct (DNA Standard 1),提示文库稀释度不够,应提高文库稀释倍数重复实验。 2. Ct (稀释文库) > Ct (DNA Standard 6),提示文库稀释度过高,应减少稀释倍数重复实验。 3. 推荐稀释度为1:1000-1:100000。对于高浓度文库,可额外设置3个2倍稀释梯度,如按1:1000稀释文库,可额外设置1:2000,1:4000,1:8000稀释比例,以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。 |
DNA Standard 1扩增曲线异常 | 不恰当的基线基线(Baseline)设置。手动调整基线(Baseline)为1-3循环。 |
DNA Standards有扩增,而文库没有或Ct很大 | 1. 文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。 2. 稀释度过高。减少稀释倍数,重复实验。 3. 文库降解。文库应现用现稀释。 |
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