Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
Hieff NGS™ DNA分选磁珠
面议Hieff NGS® Ultima Pro PCR Free DNA Library Pr
¥2475Hieff NGSTM mRNA Isolation Master Kit
面议Recombinant APOBEC3A (A3A) Protein
¥1335Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profili
¥2855Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polym
¥3015E. coli DNA ligase (60 U/μL)
¥55Hieff NGS® dsDNA Methyl Library Prep Kit for
¥3155伴刀豆球蛋白A磁珠
¥1255Oligo dT 磁珠
¥805文库构建专用接头试剂盒
¥515DNA文库接头专用配套试剂盒set2
¥8200产品描述
本产品适用于多重PCR实验。4×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen以热启动多重Taq酶制剂与4×扩增缓冲液为组分配置成预混液。本预混液可快速便捷地用于多重PCR反应,扩增子GC含量25-75%范围内可以有效扩增。具备高均一性、高特异性和高灵敏度的特点,同时严控背景菌。本试剂可兼容30~100对以内不同大小片段的多重扩增,也可用于进行数千重及以上扩增子的捕获。可应用病原微生物检测、环境微生物鉴定、食品安全检测等多个应用场景。
运输与保存方式
冰袋运输。-25 ~ -15℃储存,有效期2年。
实验流程
推荐反应体系:
一轮反应体系
组分 | 体积(μL) | 终浓度 |
4×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen | 7.5 | 1× |
Primer mix | x | 0.02 μM-0.5 μM |
模板DNA | x | 1 ng-400 ng |
无菌超纯水 | x | - |
总体积 | To30 |
【注】
1上表中DNA量和引物浓度均为推荐用量和浓度,可根据具体实验情况进行调整最适浓度。
2)参考建议:每条引物的浓度可在0.02 μM-0.5 μM范围内进行调整。
3)预混液中已经包含扩增所需要的酶、dNTP、盐离子等,无需额外添加。
二轮反应体系
组分 | 体积(μL) | 终浓度 |
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen(Cat.13581) | 15 | 1× |
Primer Index mix | 4(~6 pmol) | |
一轮纯化产物 | 11 | |
无菌超纯水 | x | - |
总体积 | To 30 |
推荐反应程序:
循环步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 3 min | 1 |
变性 | 95℃ | 30 sec | X |
退火 | 60℃ | 30 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec | |
终延伸 | 72℃ | 3 min | |
暂存 | 4℃ | - | 1 |
【注】
退火时间可以根据Panel种类不同,进行适当延长,或者是梯度退火,比如64℃ 1 min,60℃ 1 min;
延伸时间以最长片段为准。延伸时间太长会导致非特异性扩增增多,可通过缩短延伸时间来提高扩增特异性,延伸时间不少于30 sec。
针对模板含量较低的样本,可通过增加循环数提高扩增产出。
Panel引物重数较多时可增加退火时间,调整梯度退火程序,或者根据已有Panel的合适的PCR反应程序进行测试。
循环数推荐:
单管引物重数 | 推荐循环数 (10 ng gDNA ) | 退火延伸时间 | |
一轮 | 二轮 | ||
10-50 | 10~28 | 18~28 | 30 s~2 min |
50-200 | 10~28 | 16~28 | 30 s~2 min |
200-800 | 10~28 | 14~28 | 30 s~2 min |
800以上 | 10~28 | 12~28 | 30 s~4 min |
【注】
上表是基于10 ng gDNA进行的一轮及二轮循环数的推荐;当投入量大于10 ng,二轮的相应的循环数可以减少;当投入量小于10 ng,一,二轮的相应的循环数要相应的增加。
多重扩增引物纯化
一轮 PCR 产物 0.9×磁珠纯化
1) 准备工作:将 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至一轮 PCR 产物中,室温孵育 5 min。
4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约 5 min),小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始终置于磁力架中,加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育 30 sec 后,小心移除上清。
6) 重复步骤 5,总计漂洗两次。
7) 保持 PCR 管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过 5min)。
8) 直接加入 11 μL ddH2O,将 PCR 管从磁力架中取出,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置 5 min。进入下一步反应。
二轮 PCR 产物 0.9×磁珠纯化
1) 准备工作:将 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至一轮 PCR 产物中,室温孵育 5 min。
4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约 5 min),小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始终置于磁力架中,加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育 30 sec 后,小心移除上清。
6) 重复步骤 5,总计漂洗两次。
7) 磁珠晾干后,将PCR管从磁力架上取下,加入30 μL Nuclease-free ddH2O覆盖磁珠,使用移液器吹打混匀。室温孵育2 min。如果磁珠干燥开裂,适当延长孵育时间。
8)将PCR管短暂离心收集后置于磁力架中,分离磁珠和液体直到溶液澄清(约5 min)。 小心吸取25 μL上清转移至新的EP管中,继续进行下一步反应。