Hieff Trans®siRNA/miRNA体外转染试剂_细胞生物学-翌圣生物科技（上海）股份有限公司手机版

详细介绍

Hieff Trans®siRNA/miRNA体外转染试剂

产品描述

Hieff Trans®siRNA/miRNA体外转染试剂是一种非脂质体PEI阳离子、两性分子转染试剂，为siRNA转染到哺乳动物细胞中而开发。适用于siRNA和miRNA的转染。这种转染试剂包裹siRNA或miRNA形成阳离子复合物，该复合物与细胞表面带负电的蛋白聚糖相互作用吸附在细胞表面，通过内吞进入细胞，形成内含体。该转染试剂具有质子海绵的作用，能够吸收溶酶体中的H+，质子的不断流入，导致复合体肿胀破裂，从而使外源siRNA或miRNA释放到细胞质中。

该产品可在广泛的细胞系中，实现1 nM的siRNA超过90%的表达效率，避免了脱靶效应。适用于多种细胞转染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等贴壁细胞；以及难以转染的悬浮细胞系，如K562或THP-1细胞，可达到80%的沉默效率；同时还包括一些原代细胞，原代人成纤维细胞和原代人肝细胞等，可达到80%的沉默效率。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品2-8 ℃保存，一年有效。不可冷冻！

注意事项

1）整个实验过程使用无RNA酶和无热原性的材料，如离心管、枪头、缓冲液。

2）转染前，确保siRNA是经过PAGE纯化和脱盐处理过的，高纯度的siRNA或者miRNA有助于获得较高的转染效率。

3）PEI阳离子转染试剂应该在2-8 ℃保存，要注意避免多次反复长时间开盖，否则可能会导致PEI挥发，降低转染效率。

4）转染前一天，确保接种贴壁细胞密度在30%-50%左右，对于一些小细胞和生长缓慢的细胞，接种密度可适当扩大2倍。

5）转染前，确保siRNA/miRNA基因沉默表达不会影响细胞活力。

6）该产品只适合体外转染，不能用于体内转染。

7）本产品仅作科研用途！

操作流程

一．贴壁细胞转染（以24孔板和转染1 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表1）
接种贴壁细胞

1.为了提高转染效率，建议在转染前一天接种细胞，接种细胞密度建议30%-50%左右，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。

2.按照以下体系配制siRNA-PEI或miRNAPEI子核酸转染试剂阳离复合物：

1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释8.4 ng siRNA (0.6 pmoles)，混匀。

2）立刻向100 μL的siRNA中加入2 μL的转染试剂，旋涡10秒，充分混匀。

3）在室温下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30min

4）在形成复合物过程中，移除细胞生长培养基，每孔中加入500 μL新鲜预热的*全培养基。

5）直接将100 µL siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物加入细胞中，摇动培养板，轻轻混匀。最终体积为600 µL ，siRNA终浓度为1 nM。

6）37 ℃，5% CO2培养箱培养，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24-72 h，蛋白表达水平在48-96 h。

图1 转染贴壁细胞操作流程

【注】：由于靶基因、细胞类型、siRNA效价、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周转率等因素，均会影响siRNA的转染效率。建议选取siRNA浓度在1 nM到10 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表1。

表1 siRNA终浓度为1 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值

培养皿	siRNA物质的量(pmoles)	每孔siRNA的含量（ng）	siRNA转染试剂体积（µL）	形成PEI-siRNA复合物的体积（µL）	*全培养基的体积（含血清+双抗）	加入复合物后，细胞培养基总体积
96孔板	0.17	2.4	0.7-0.8	50	125 µL	175 µL
24孔板	0.6	8.6	1-3	100	500 µL	600 µL
12孔板	1.2	17	2-6	200	1 mL	1.2 mL
6孔板	2.2	31	4-12	200	2 mL	2.2 mL
25cm2培养瓶	4.4	62	10-20	400	4 mL	4.4 mL
75cm2培养瓶	10.5	147	30-50	500	10 mL	10.5 mL

表2 siRNA终浓度为10 - 50 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值

培养皿	siRNA转染试剂体积（µL）	形成复合物的体积（无血清培养基）（µL）	*全培养基的体积（含血清+双抗）	加入复合物后，细胞总体积
96孔板	0.5-1.5	50	125 µL	175 µL
24孔板	2-4	100	500 µL	600 µL
12孔板	4-8	200	1 mL	1.2 mL
6孔板	8-16	200	2 mL	2.2 mL
25cm2培养瓶	15-25	400	4 mL	4.4 mL

二．悬浮细胞转染（以24孔板和转染5 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表4）
接种细胞

1.为了优化悬浮细胞转染条件，与贴壁细胞相比，需要降低悬浮细胞培养基的体积。根据培养皿大小和完整培养基的体积，推荐接种悬浮细胞的数量如下表3所示。

表3 转染当天，根据培养皿的大小，接种悬浮细胞数量参考值

培养皿	底面积(cm2)	每孔接种细胞悬浮液体积（μL）	转染当天接种细胞数
384孔板	0.1	25	5 ×103~1×104
96孔板	0.32	50	1×104~ ×104
24孔板	2	200	1×105 ~ 2×105
12孔板	4.5	500	2×105 ~ 4×105
6孔板	9.6	1000	5×105 ~ 2×106
25cm2培养瓶	25-28	2000	2×106~ 5×106

2.按照以下体系配制siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物：

1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释21 ng siRNA (1.5 pmols)，混匀。

2）向100 μL的siRNA中加入4 μL的转染试剂，立刻旋涡10秒，充分混匀。

3）在室温孵育15 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30 min

4）在每孔200 μL细胞悬浮液中，加入100 μL的siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物，轻轻混匀。最终体积为300 µL，siRNA终浓度为5 nM。

5）37 ℃，5% CO2培养箱培养4-6 h后，再加入700 µL*全培养基，轻轻摇动培养板使其混匀。

6）继续放入培养箱中孵育，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24-72 h，蛋白表达水平在48-96 h。

【注】：为了优化内源性基因沉默，建议选取siRNA浓度在5 nM到20 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表4。

表4 siRNA浓度为5 nM时，在悬浮细胞中的参考值

培养皿	siRNA的浓度(pmoles)	每孔siRNA的含量（ng）	转染试剂体积（µL）	形成复合物培养基体积（µL）	悬浮细胞的体积	转染4-6h后另加入培养基的体积
384孔板	0.25	3.75	1 ± 0.5	25	25 µL	0 µL
96孔板	0.5	7.5	2 ± 1	50	50 µL	100 µL
24孔板	1.5	21	3 ± 2	100	200 µL	700 µL
12孔板	3.5	49	6 ± 4	200	500 µL	1 mL
6孔板	6	84	10 ± 8	200	1 mL	2 mL
25cm2培养瓶	12	168	15 ±10	400	2 mL	4 mL

表5 悬浮细胞中siRNA浓度、转染试剂的用量参考值

培养皿	siRNA的终浓度/孔（nM）	转染试剂的体积/孔（µL）
96孔板	1 ~ 20	1 ± 0.5
24孔板		2 ± 1
12孔板		3 ± 2
6孔板		10 ± 8
96孔板	20 ~ 50	1.5 ± 0.5
24孔板		3 ± 1
12孔板		5 ± 2
6孔板		15 ± 8

三．miRNA转染操作流程
该转染试剂也适合转染miRNA，转染贴壁细胞和悬浮细胞的具体操作请参考siRNA的操作流程。

HB220930

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