Hieff NGS® eTAPS酶法DNA甲基化转化试剂盒

产品信息

产品描述

Hieff NGS^® eTAPS Enzymatics Methyl-seq Conversion Module是翌圣生物科技（上海）股份有限公司开发的一款高效DNA甲基化位点转化试剂盒（eTAPS技术），可以将甲基化的胞嘧啶（5mC）特异性地转化成尿|嘧|啶（U）。最终，eTAPS技术可以高效特异性地将甲基化的胞嘧啶（5mC）转变成胸腺嘧啶（T），通过C>T突变来实现单碱基分辨率和高准确性的DNA甲基化正向筛选和鉴定，适用于1-200 ng起始量的DNA样本。本试剂盒流程包括eTET酶氧化、转化剂转化和磁珠回收三个步骤，具有转化效率高、操作简便、特异性好、回收率高等优点。

产品组分

运输与保存方法

干冰运输。效期一年。-20℃保存，切不可搞错！

注意事项

一、 关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

5. 本产品仅用作科研用途！

二、应用范围

本试剂盒适用于DNA甲基化（DNA 5mC）研究，针对的DNA投入量为1-200 ng，也提供了应用于RNA 甲基化（RNA 5mC）的可能性。

三、关于DNA材料

1. 请不要用包含EDTA的缓冲液溶解DNA材料。若溶解DNA的缓冲液中包含EDTA，我们推荐先进行NGS建库，在PCR扩增前再使用本试剂盒进行DNA甲基化转化。

四、关于试剂和操作注意事项

1. eTET1为二价金属依赖性DNA双加氧酶，因此对氧化体系中EDTA较为敏感。请不要用包含EDTA的缓冲液溶解DNA材料。若使用EDTA的缓冲液溶解DNA材料，我们建议进行一轮DNA回收进行纯化，或者对eTET1 Enhancer的投入量进行重新滴定，以达到eTET1最佳的氧化效果。对于DNA NGS建库，若起始DNA溶解液较为复杂，建议先进行DNA建库步骤（如DNA|片段化、末端修复、接头连接和磁珠回收），使用ddH2O溶解回收的DNA，再使用本试剂盒对DNA进行eTAPS转化，最后进行文库扩增。

2. eTET1 Enhancer容易被氧化，收到后建议分装保存于-20℃。短时间内不用，建议-80℃保存。

3. Conversion Enhancer有轻微挥发性和刺激性，使用时请保证操作环境通风，并戴好口罩和防护眼镜。

4. Neutralizer具有强碱性，在使用过程中请做好防护。滴到皮肤上，应先用干净布拭去，然后用大量水清洗，最后涂抹稀硼酸稀溶液。滴到实验台上，用湿抹布擦去即可。

5. 2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反应液，主要用于eTAPS转化后DNA的扩增。在NGS建库过程中，请用此酶代替建库试剂盒中的扩增mix，以保证更高效的文库扩增和保真性。若使用转座酶法建库，则无须进行扩增mix的替换。

五、关于DNA甲基化标准品

Specific Methylated Site DNA使用的是一段人工合成的DNA|片段，片段上包含三个DNA甲基化位点，两个甲基化位点主要用于评判eTAPS的转化效率。序列如下(下划线碱基C即为甲基化的C)：

AGTGACGCATGATCTGTACGATCGACCGTGCAACCCGACGCATGATCTGTACTGATCGACCGTGCAACAGCAGTCTCGATCAGCTGCTCCGCATGCAAGTAGCGGTACTAACGTACAGTACGATGCTAGCTAGTGCTTAGGATCGAGATCGCAGAAGGGCAAGCATTAGCTATCGATCGAGCACTACTAGCTAGCATCCGATCGATCATCGTCACGGTACGTCCAGC。

Specific Methylated Site DNA的浓度为100 pg/μL，在使用过程中请根据自身DNA投入量进行添加。我们推荐的投入DNA和Specific Methylated Site DNA比例为100-1000:1。

六、自备材料

1. DNA回收：我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)进行DNA回收，也可以使用柱回收和

AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行代替。

2. DNA建库试剂盒：我们推荐使用以下DNA建库试剂盒进行illumina或者MGI文库的构建：

全能型DNA建库试剂盒(Yeasen Cat#12199、12200、12201、13310)

一步法DNA建库试剂盒(Yeasen Cat#12203、12204、12205、13321、13322)

单链DNA建库试剂盒(Yeasen Cat#12211)

3. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪、恒温震荡仪等。

使用方法

一、操作流程

图1.eTAPS酶法DNA甲基化转化试剂盒原理示意图和建库操作流程

二、操作步骤（操作前请仔细阅读操作注意事项）

2.1 eTET1酶处理

1. 将表1中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用（eTET1 Enhancer解冻混匀后放置在冰上）。

2. 于无菌PCR管中配制表1所示反应体系。

表1 eTET1氧化反应体系

3. 37℃反应1.5 h。加入1 μL Termination Buffer和1 μL Termination Enzyme。（若为了更好的转化效果，此处可以将PCR管放在PCR仪中50 ℃处理 10 min）。

2.2 转化剂处理

1. 将表2中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表2所示反应体系。

表2 转化剂处理反应体系

【注】：Conversion Enhancer和Reagent需要单独添加，请不要提前混成mix。

3. 37℃反应14-18 h（混匀后可以在PCR仪中反应，热盖50℃）。

4. 反应结束后，加入22 μl Neutralizer，混匀。

2.3 磁珠回收

1. 加入120 μL室温下平衡的DNA Selection Beads，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置孵育10-15 min。

2. 短暂离心（<100×g），将离心管置于磁力架上静置3 min，待磁珠*贴壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始终处于磁力架中，从另一侧加入200 μL 80％乙醇，避免直接冲刷磁珠，静置60 s。吸除液体，保持PCR管始终处于磁力架中，再次加入200 μL 80％乙醇，静置60 s。吸除干净液体，保持PCR管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过3 min）。从磁力架上取下PCR管，加入21 μL ddH2O，并充分涡旋。室温静置5 min。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中，于-20℃保存。

2.4 DNA建库

按照推荐的试剂盒说明书进行文库构建。我们推荐使用以下DNA建库试剂盒进行illumina或者MGI文库的构建：

全能型DNA建库试剂盒(Yeasen Cat#12199、12200、12201、13310)

一步法DNA建库试剂盒(Yeasen Cat#12203、12204、12205、13321、13322)

转座酶DNA建库试剂盒（Yeasen Cat#12206、12207）

单链DNA建库试剂盒(Yeasen Cat#12211)

【注】2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反应液，主要用于eTAPS转化后DNA的扩增。在NGS建库过程中，请用此酶代替建库试剂盒中的扩增mix，以保证更高效的文库扩增和保真性。

HB211029