丙酮酸（PA）含量检测试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2200

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 标准品：20μmol/mL丙酮酸钠标准溶液。

2、 0.125μmol/mL标准溶液的配制：取50μL 20μmol/mL 标准液和450μL蒸馏水混匀，即2μmol/mL 标准液；再取50μL 2μmol/mL 标准液和750μL蒸馏水混匀即配成0.125μmol/mL标准溶液。

技术指标：

低检出限：0.001 μmol/mL

线性范围：0.0015-0.25 μmol/mL

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，200W，超声3s，间隔10s，重复30次），静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。

3、血清（浆）样本等液体：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取0.1mL液体样本加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：（在1.5mL EP管中加入下列试剂）

三、丙酮酸含量计算

1、按照血清（浆）体积计算

丙酮酸含量（μmol/mL）= ΔA测定÷ΔA标准×C标准×（V提取+V液体）÷V液体 = 0.1375×ΔA测定÷ΔA标准

2、按照样本蛋白浓度计算

丙酮酸含量（μmol /mg prot）= ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V样本÷(V样本×Cpr) =0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

3、按照样本质量计算

丙酮酸含量（μmol /g 质量）= ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V提取÷W=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W

4、按照细菌或细胞数量计算

丙酮酸含量（μmol /10⁴ cell）= ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V提取÷N=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷N

C标准：0.125μmol/mL 标准溶液；V样本：加入反应体系中样本体积，0.3mL；V提取：加入提取液体积，1mL；V液体：加入血清（浆）等液体体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以万计。

注意事项：

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

2. 提取液中含有蛋白变性成分，若使用蛋白浓度计算需要另取样本提取测定。

实验实例：

1. 称取约0.1171g兔肝，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.570-0.101=0.469，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.541-0.101 =0.440，计算丙酮酸含量得：PA（μmol/g 质量）=0.125 ×ΔA测定÷ΔA标准÷W =1.138μmol/g 质量

2. 称取约0.1094g合欢，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清用蒸馏水稀释2倍后待测。之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.886- 0.101=0.785，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.541-0.101 =0.440，计算丙酮酸含量得：PA（μmol/g 质量）=0.125 ×ΔA测定÷ΔA标准÷W ×稀释倍数=4.077μmol/g 质量

3. 取50μL兔血清之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.146-0.101=0.045，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.541-0.101 =0.440，计算丙酮酸含量得：PA（μmol/mL）=0.1375 ×ΔA测定÷ΔA标准 =0.014μmol/mL

相关发表文献：

[1] Yao R, Yang Y, Lian S, et al. Effects of acute cold stress on liver O-GlcNAcylation and glycometabolism in mice[J]. International journal of molecular sciences, 2018, 19(9): 2815.

[2] Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al. Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)

[3] Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6):2715-2729. (IF3.67)

[4] Luo M,Luo Y, Mao N,et al. Cancer-Associated Fibroblasts Accelerate Malignant Progression of Non-Small Cell Lung Cancer via Connexin 43-Formed Unidirectional Gap Junctional Intercellular Communication. Cellular Physiology and Biochemistry. November 2018

参考文献：

[1] Venkatesh C, Ramalingam K. Lactic acid, pyruvic acid and lactate/pyruvate ratio in the Anoplocephalid tapeworm Stilesia globipunctata infecting sheep (Ovis aries)[J]. Veterinary parasitology, 2007, 144(1-2): 176-179.

[1] Randle W M, Bussard M L, Warnock D F. Ontogeny and Sulfur Fertility Affect Leaf Sulfur in Short-day Onions [J]. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1993, 118(6): 762-765.

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