D-乳酸（D-LA）含量检测试剂盒（WST显色法）说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC5350

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：  

1、 试剂二：临用前取一支加入160μL蒸馏水溶解。2-8℃可以保存4周（该试剂为冻干试剂，可能存在肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同）；

2、 试剂二工作液的配制：临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：90μL（1T）的比例配制，现用现配，用多少配多少；

3、 试剂三：临用前加入15 mL 蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存4周；

4、 标准品：1000μmol/mL D-乳酸标准液。临用前取20μL 1000μmol/mL D-乳酸标准液和1980μL蒸馏水混合配成10μmol/mL 标准溶液；再吸取20μL 10μmol/mL 标准溶液和620μL蒸馏水混合配成0.3125μmol/mL 标准溶液备用。

产品说明：

乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。D-乳酸在D-乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD⁺还原生成NADH和H⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH反应，产生水溶性formazan，其在450nm处有最大吸收峰，据此可计算D-乳酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、分析天平、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、离心机、1mL玻璃比色皿、水浴锅/恒温培养

箱、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，12000g离心10min后取上清待测。

注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。

二、测定步骤

1、分光光度计预热30min以上，波长调至450nm，蒸馏水调零。

2、加样表：（按顺序将下列试剂加在EP管中）

三、D-乳酸含量的计算

1. 按照蛋白含量计算

D-LA含量（μmol/mg prot）= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V样本÷（V样本×Cpr）
= 0.3125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2. 按照样本质量计算

D-LA含量（μmol/g 质量）

= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）

=0.3711×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3. 按照细胞数量计算

D-LA含量（μmol/10⁶ cell）

= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）

= 0.3711×ΔA测定÷ΔA标准÷N

4. 按照液体体积计算

D-LA含量（μmol/mL）

=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]

=4.082×ΔA测定÷ΔA标准

C标准：标准溶液浓度，0.3125μmol/mL；V样本：加入的样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；N：细胞数量，以10⁶计；V液体：液体样本体积，0.1mL。

注意事项：

1. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。

2. ΔA测定的测定范围在0.01-1.2之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定，如果测定吸光值小于线性范围吸光值，需要增加样本量后再次测定，注意同步计算公式。

实验实例：

1、 取0.104g兔肌肉加入1mL提取液一，冰浴匀浆后离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后按照测定步骤操作，使用比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.637-0.308=0.329，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.636-0.124=0.512，按照样本质量计算含量得：

D-LA含量（μmol/g 质量）= 0.3711×ΔA 测定÷ΔA标准÷W =2.2929 μmol/g质量。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，使用比色皿测得计算ΔA测定管=A测定管-A对照管=0.356-0.302=0.054，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.636-0.124=0.512，按照液体体积计算含量得：

D-LA含量（μmol/mL）=4.082×ΔA 测定÷ΔA标准=0.4305 μmol/mL。

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