丙酮酸激酶（PK）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0540

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二A：临用前加入1.2mL蒸馏水溶解，用不完的试剂可-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂二B：临用前取一支加入0.7mL蒸馏水溶解，用不完的试剂可-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3、 试剂三：临用前加入1.8mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂可-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

4、 试剂四：临用前根据用量按照试剂四：蒸馏水=5μL:100μL（7T）的体积比例充分混匀，冰上放置备用，现用现配；

5、 工作液的配制：按试剂一：试剂二A：试剂二B = 860μL：20μL：20μL（1T）的比例配制，现用现配。

产品说明：

PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。

Phosphoenolpyruvic Acid + ADP                     Pyruvic Acid + ATP

Pyruvic Acid + NADH (340nm)                           Lactate + NAD⁺

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）等其他液体：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 工作液临用前于37℃预热10min。

3. 加样表：

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm下比色，记录2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

三、PK活性的计算

1. 按液体体积计算

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PK活性（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷V样÷T=2613×ΔA

2. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PK活性（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷(Cpr×V样)÷T=2613×ΔA÷Cpr

3. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PK活性（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷(W×V样÷V样总)÷T=2613×ΔA÷W

4. 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PK活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷(N×V样÷V样总)÷T=2613×ΔA÷N

V反总：反应体系总体积，9.75×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以万计。

注意事项：

1、 测定过程中试剂四、样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、 比色皿中反应液的温度尽量保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

实验实例：

1. 称取约0.1g 兔心，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清用提取液稀释16倍后置冰上待测。之后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算A1=0.690，A2=0.369，ΔA=A1-A2=0.321，计算丙酮酸激酶活性得：PK活性（U/g 质量）=2613×ΔA÷W×16（稀释倍数）=134203.68 U/g 质量

2. 取30μL牛血清直接进行检测，用1mL石英比色皿测得计算A1=0.785，A2=0.658，ΔA=A1-A2=0.127，计算丙酮酸激酶活性得：PK活性（U/mL）=2613×ΔA =331.851 U/mL

3. 称取约0.1g 绿萝叶片，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。之后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算A1=0.866，A2=0.853，ΔA=A1-A2=0.013，计算丙酮酸激酶活性得：

PK活性（U/g 质量）=2613×ΔA÷W=336.69 U/g 质量

相关发表文献：

[1] Liu Y, Liang X, Zhang G, et al. Galangin and pinocembrin from propolis ameliorate insulin resistance in HepG2 cells via regulating Akt/mTOR signaling[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2018, 2018.

[2] Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.

参考文献：

[1] Lepper T W, Oliveira E, Koch G D W, et al. Lead inhibits in vitro creatine kinase and pyruvate kinase activity in brain cortex of rats[J]. Toxicology in Vitro, 2010, 24(3): 1045-1051.

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