SOLARBIO/索莱宝 品牌
生产厂家厂商性质
北京市所在地
L-乳酸（L-LA）含量检测试剂盒（WST显色法）说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC5340
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体60 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体12 mL×1瓶 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：450μL（9T）的比例配制试剂二溶液，现用现配；
2、 试剂三：临用前加入8 mL 蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；
3、 标准品：临用前加入1.04 mL蒸馏水配成100 μmol/mL 的标准溶液，2-8℃可保存12周；
产品说明：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD+还原生成NADH和H+，在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH反应，产生水溶性formazan，其在450nm处有最大吸收峰，据此可计算乳酸含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
分析天平、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、水浴锅/恒温培养箱、蒸馏水。
操作步骤：
一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
2. 细胞/细菌：按照细胞/细菌数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞/细菌加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞/细菌（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
3. 血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，波长调至450nm，蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：将100μmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释为0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.020、0.01μmol/mL的标准溶液备用。
3、标准品稀释表：
序号 | 稀释前浓度（μmol/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（μmol/mL） |
1 | 100 | 50 | 950 | 5 |
2 | 5 | 100 | 700 | 0.625 |
3 | 0.625 | 200 | 200 | 0.3125 |
4 | 0.3125 | 200 | 200 | 0.15625 |
5 | 0.15625 | 200 | 200 | 0.078 |
6 | 0.078 | 200 | 200 | 0.039 |
7 | 0.039 | 200 | 200 | 0.020 |
8 | 0.020 | 200 | 200 | 0.010 |
实验中每个标准管需50µL标准溶液
3、加样表：（按顺序将下列试剂加在EP管中）
测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |
样本（μL） | 50 | 50 | - | - |
标准品（μL） | - | - | 50 | - |
蒸馏水（μL） | - | 50 | - | 50 |
试剂一（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂二（μL） | 50 | - | 50 | 50 |
试剂三（μL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
试剂四（μL） | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混匀，于37℃水浴锅/恒温培养箱避光准确反应30min。 | ||||
蒸馏水（μL） | 450 | 450 | 450 | 450 |
混匀后，取出全部反应液到1mL比色皿中，于450nm处测定吸光值，分别记为A测定管，A对照管，A标准管，A空白管，计算ΔA测定=A测定管-A对照管；ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设置一个对照管，空白管和标准曲线只需测定1-2次。 | ||||
三、乳酸含量的计算
1、标准曲线的绘制
以各标准溶液浓度为x轴，以其对应的吸光值（ΔA标准）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将
ΔA测定带入公式中得到x（μmol/mL）。
2、乳酸含量计算
（1）按照蛋白含量计算
L-LA含量（μmol/mg prot）=x×V样本÷（V样本×Cpr）=x÷Cpr
（2）按照样本质量计算
L-LA含量（μmol/g 质量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W
（3）按照细胞/细菌数量计算
L-LA含量（μmol/104 cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷N
（4）按照液体体积计算
L-LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]=13.0625×x
V样本：加入的样本体积，0.05mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；N：细胞/细菌数量，104个；V液体：液体样本体积，0.1mL。
注意事项：
1. ΔA测定的测定范围在0.01-1之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定，如果测定吸光值小于线性范围吸光值，需要增加样本量后再次测定，注意同步计算公式。
2. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取样本。
实验实例：
1、 取0.1466g小鼠肝加入1mL提取液一，冰浴匀浆后离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后用蒸馏水稀释两倍，按照测定步骤操作，使用1mL比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.972-0.092= 0.880，根据标准曲线y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，计算x=0.6477，按样本质量计算含量得：
L-LA含量（μmol/g 质量）= 1.1875×x÷W×稀释倍数（2）=10.493 μmol/g质量。
2、 取0.1063g红薯根加入1mL提取液一，冰浴匀浆后离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，使用1mL比色皿测得计算ΔΔA测定=A测定管-A对照管=0.124-0.099=0.025，根据标准曲线y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，计算x=0.0213，按样本质量计算含量得：
L-LA含量（μmol/g 质量）=1.1875×x÷W=0.2382μmol/g质量。
3、 取100μL羊血清加入1mL提取液一，离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，使用1mL比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.587-0.095=0.492，根据标准曲线y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，计算x=0.3634，按照液体体积计算含量得：
L-LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=4.748 μmol/mL。
参考文献：
Eolbergrová J, MacMillan V, Siesjö B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD+ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.
相关系列产品：
BC0740/BC0745 己糖激酶（HK）活性检测试剂盒
BC0540/BC0545 丙酮酸激酶（PK）活性检测试剂盒
BC0530/BC0535 磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒
L -乳酸（L -LA）含量检测试剂盒 糖酵解 L -乳酸（L -LA）含量检测试剂盒 糖酵解
