Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶 | 11111ES92 | 10000 U | 1426.00 |
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶 | 11111ES93 | 50000 U | 4626.00 |
产品描述
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase是在Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase基础上通过基因工程技术得到的新一代逆转录酶，与Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase相比，其cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达19.8 kb的cDNA。
产品组分
编号 | 组分 | 产品编号/规格 | |
11111ES92 (10000 U) | 11111ES93 (50000 U) | ||
11111-A | 5×Hifair® Ⅲ Buffer | 250 μL | 1250 μL |
11111-B | Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 50 μL | 250 μL |
产品应用
全长cDNA文库构建；终点法PCR；实时定量PCR等。
活性定义
以Poly(A) .Oligo(dT)为模板-引物，在37℃，10 min内，将1 nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
运输与保存方法
冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。
注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染；
2）所有操作均应在冰上进行，防止RNA降解；
3）为保证高效率逆转录，建议使用高质量的RNA样本；
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途。
第一链cDNA合成操作步骤
1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）
组分 | 使用量 |
RNase free H2O | to 13 μL |
Oligo (dT)18 (50 μM) | 1 μL |
or Random Primers (50 μM) | or 1 μL |
or Gene Specific Primers (2 μM) | or 1 μL |
模板RNA | Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng |
65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
组分 | 使用量 |
上一步的反应液 | 13 μL |
5×Hifair® Ⅲ Buffer | 4 μL |
dNTP Mix (10 mM) | 1 μL |
Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 μL |
RNase inhibitor (40 U/µL) | 1 μL |
3. 逆转录程序设置
温度 | 时间 |
25℃ | 5 min |
55℃ | 15-30 min |
85℃ | 5 min |
【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略；
2）逆转录温度：推荐使用55℃；对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃；
3) 可将逆转录时间延长到45-60min，有助于提高产量；
4）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
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