11139ES60Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （gD
Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES60 | 100 T | 1303.00 |
产品描述
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第—链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。
该试剂盒包含gDNA Digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。
产品组分
编号 | 组分 | 11139ES60 (100 T) |
11139-A | RNase-free ddH2O | 1 mL×2 |
11139-B | 5×gDNA Digester Mix | 300 μL |
11139-C | 10×Hifair® III Super Buffer1 | 200 μL |
11139-D | Hifair® III RT Enzyme Mix2 | 100 μL |
11139-E | Random Primers N6 (50 μM ) | 100 μL |
11139-F | Oligo (dT)18 (50 μM) | 100 μL |
【注】：1) 10×Hifair® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。
2) Hifair® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。
运输与保存
冰袋运输。-20℃保存，有效期18个月。
注意事项
1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。
2）建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
3）5×gDNA Digester Mix、10×Hifair® III Super Buffer、Hifair® III RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀，并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器，枪头不要插入液面下过深。
4）qPCR实验推荐基因组去除步骤，保证结果更加真实可靠。
关于逆转录引物的选择
1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18 ，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得///高产量的全长cDNA。
2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。
3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
第—链cDNA合成操作步骤
一、若实验需要去除残留基因组DNA
1. gDNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。
组分 | 使用量 |
RNase-free ddH2O | To 15 μL |
5×gDNA Digester Mix | 3 μL |
Total RNA | 10 pg -5 μg* |
or mRNA | 10 pg-500 ng* |
【注】：* 若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为10 pg -1 μg；mRNA的投入量为10 pg-100 ng。若基因的表达丰度很低，多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。
2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
组分 | 使用量（μL） |
上一步的反应液 | 15 |
10×Hifair® III Super Buffer | 2 |
Hifair® III RT Enzyme Mix | 1 |
Random Primers N6 (50 μM) | 1 |
or Oligo (dT)18 (50 μM) | or 1 |
or Gene Specific Primer (2 μM) | or 1 |
RNase-free ddH2O | to 20 |
【注】：1）逆转录引物：后续进行qPCR时，推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。
2）建议先加入10×Hifair® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证*抑制gDNA Digester的活性。
3）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。
3. 逆转录程序设置
温度 | 时间 |
25℃ | 5 min |
55℃1 | 15 min2 |
85℃ | 5 min |
【注】：1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。
2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。
4. 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，-80℃保存，避免反复冻融。
二、若实验无需去除基因组DNA
1. RNA模板变性
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5 min，迅速置于冰上，并静置3 min。
组分 | 使用量 |
RNase-free ddH2O | To 17 μL |
Total RNA | 10 pg -5 μg |
or mRNA | 10 pg-500 ng |
Random Primers N6 (50 μM) | 1 μL |
or Oligo (dT)18 (50 μM) | 1 μL |
or Gene Specific Primer (2 μM) | or 1 μL |
2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
组分 | 使用量 |
上一步的反应液 | 17 μL |
10×Hifair® III Super Buffer | 2 μL |
Hifair® III RT Enzyme Mix | 1 μL |
【注】：体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。
3. 参照上述程序进行后续上机实验。
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