产品信息

产品描述

Hifair^® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair^® Ⅱ Reverse Transcriptase而开发。该酶热稳定性大幅度提高，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^® Ⅱ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6 和oligo (dT)₁₈，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品组分

【注】：1）5×Hifair^® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制剂和dNTP；2）Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。

运输与保存

冰袋运输。-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

2）建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

3）可以不经过基因组去除步骤，直接进行逆转录，这样所得到的结果与使用Hifair^® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat No. 11119ES）效果一致。但是请勿将gDNA digester与11119ES中的5×Hifair^® Ⅱ Buffer配套使用，因其不含终止gDNA 去除反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验。
4）本产品仅作科研用途！

关于逆转录引物的选择

1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈ ，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

4）使用Random primers N6，进行2 kb以下的cDNA合成时，Random primers N6的使用量为 1-2 μL；2 kb 以上的cDNA合成时，Random primers N6 的使用量为0.4-1 μL。

第一链cDNA合成操作步骤

一、若实验需要去除残留基因组DNA

1. 在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

【注】：* 若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为1 ng -1 μg；mRNA的投入量为1 ng-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

【注】：1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈ 1:1混合使用。

2）5×Hifair^® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因gDNA digester buffer的影响，本体系中只需要加2 μL。

3）建议先加入5×Hifair^® Ⅱ Buffer plus混匀后再添加反转录引物，以保证*抑制gDNA digester的活性。

3. 逆转录程序设置

【注】：逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。

4. 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

二、若实验无需去除基因组DNA

1. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

【注】：1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈ 1:1混合使用。

2）5×Hifair^® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因无gDNA digester buffer的影响，本体系中需要添加4 μL。

【可选步骤】：针对复杂模板，建议RNA、H₂O、反转录引物在65℃保温5 min 后，冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶和Buffer。

2. 逆转录程序设置参照上述基因组去除后的逆转录程序。

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