Yeasen/翌圣生物 品牌
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Hieff NGS™ DNA分选磁珠
面议Hieff NGSTM mRNA Isolation Master Kit
面议phi29 DNA Polymerase (10 U/μL)
¥585Recombinant Ten-Eleven Translocase
¥1555Recombinant Ten-Eleven Translocase (TET)14
¥15554×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen
¥725Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polym
¥30154× Frag/Prime Buffer
¥102伴刀豆球蛋白A磁珠
¥1255Oligo dT 磁珠
¥805文库构建专用接头试剂盒
¥515DNA文库接头专用配套试剂盒set2
¥8200产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格(元) |
Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI® | 13321ES16 | 16 T | 5363 |
13321ES96 | 96 T | 26563 |
产品描述
Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®是针对MGI®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较,本品采用高质量的片段化酶,摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,将片段化模块与末端修复模块合二为一,极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优xiu的文库转化率,可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本,同时能兼容FFPE DNA样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。
Ø 适用10 ng-1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本
Ø 高质量片段化酶,可随机切割双链DNA,酶切片段无偏好性
Ø 片段化、末端修复/加A一步完成
Ø 强扩增效率的高保真酶,显著提高文库质量及产量
Ø 适用于FFPE DNA样本
Ø 严格的批次性能与稳定性质控
产品组分
组分编号与名称 | 13321ES16 | 13321ES96 | ||
13321-A | 160 μL | 960μL | ||
13321-B | Ligation Enhancer | 480 μL | 4×720μL | |
13321-C | Fast T4 DNA Ligase | 80 μL | 480μL | |
13321-D | 2×Ultima HF Amplification Mix | 400 μL | 4×600μL | |
13321-E | Primer Mix for MGI® | 80 μL | 480μL |
运输与保存方法
冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。
二、关于DNA///片段化
1. 本试剂盒兼容范围为10 ng – 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高质量Input DNA。
2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中进行片段化。
3. 对于常规的高质量基因组DNA,酶切时间参考表5,本试剂盒片段化偏好低,耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本,酶切时间参考表6。以上为推荐时间,需客户在自己的实验体系中进行微调,以达到蕞佳效果。
4.为保证优质精确的片段化效果,片段化反应配制过程请于冰上操作。
5. 针对FFPE DNA建库,若样本质量不佳,客户对当前建库产量不满意,可选购我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)对FFPE DNA进行修复,具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行,无需额外的操作。
三、关于接头连接(Adapter Ligation)
1. 目前华大智造有2种序号的接头:1-128和501-596。关于其使用要求,请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外,华大智造申明:2种接头由于设计工艺不同,禁止混用,否则测序数据无法拆分!
2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。请按照表1和实际DNA投入量确实确定接头用量,需要稀释接头时,请用TE buffer对接头进行稀释。
表1 10ng-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度
Input DNA | 10μM Adapter稀释倍数 | 稀释后投入量(μL) |
31ng-1 μg | 不稀释 | 5 |
10-30 ng | 5 | 5 |
四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. DNA///片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前,或接头连接后,或文库扩增后进行。
2. 当Input DNA质量≥50 ng,您可选择在接头连接后分选;如Input DNA质量<50 ng,建议您在文库扩增后进行分选。
3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG,会对双轮分选产生显著影响。因此,如在接头连接后进行长度分选,必须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选,可直接进行双轮磁珠分选步骤。
4. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。
5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
6. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
8. 进行长度分选时,初始样品体积应尽量≥100 μL,不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。
9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
10. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于4°C可保存1-2周,-20°C可保存1个月。
五、关于文库扩增(Library Amplification)
文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒,获得1 μg文库的推荐循环数。
表2 10 ng-1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表
Input DNA(ng) | Number of cycles required to generate |
1 μg | |
1 μg | 3 - 5 |
500 ng | 4 - 6 |
200 ng | 5 - 7 |
50 ng | 8 - 10 |
10 ng | 10 - 12 |
【注】:建库过程中若进行片段分选,扩增时请参照较高循环数扩增。
六、关于文库质检(Library Quality Analysis)
1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR定量的方法。
3. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。
4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。
5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
使用方法
一、自备材料
1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. DNA质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。
3. DNA Adapter:华大智造或本公司
4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
图1 OnePotTM II DNA建库试剂盒操作流程
三、操作步骤
3.1DNA///片段化/末端修复/dA尾添加(DNAFragment/End Preparation/dA-Tailing)
该步骤将基因组DNA///片段化,同时进行末端修复及dA尾添加。
1. 将表3中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于冰上配制表3反应体系。
表3 DNA///片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系
名称 | 体积(μL) |
Input DNA | x |
Smearase® Mix | 10 |
ddH2O | Up to 60 μL |
3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表4所示反应程序,进行DNA///片段化,末端修复及dA尾添加反应。
表4 DNA///片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应程序
温度 | 时间 |
热盖105°C | On |
4 °C | 1 min* |
30 °C | 3-20 min** |
72 °C | 20 min |
4 °C | Hold |
【注】:*DNA///片段化过程为有效控制片段化效果,避免过度酶切,反应程序可预先设置4°C,待模块温度降至4°C时,将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA,酶切时间参考表5;对于质量不一的FFPE DNA样本,酶切时间参考表6。
图2 Agilent 2200定义不同降解程度样本的DIN值
3.2 接头连接(Adapter Ligation)
该步骤将3.1步骤的产物末端,连接特定的MGI®接头。
1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
3. 于3.1步骤PCR管中配制表7所示反应体系。
名称 | 体积(μL) |
dA-tailed DNA(3.1步骤产物) | 60 |
Ligation Enhancer | 30* |
Fast T4 DNA Ligase | 5 |
DNA Adapter | 5 |
表7 Adapter Ligation PCR体系
【注】:*Ligation Enhancer比较粘稠,请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。
4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表8所示反应程序,进行接头连接反应。
表8 Adapter Ligation PCR反应程序
温度 | 时间 |
热盖105°C | Off |
20°C | 15 min |
4°C | Hold |
【注】:当Input DNA量较低,实验效果不理想时,可尝试将连接时间延长一倍。
3.3 连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)
该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
3.3.1 纯化操作步骤:
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取80μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:
1)如产物无需进行片段分选,直接加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠
2)如产物需进行双轮分选,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。
3.3.2 双轮分选操作步骤:
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡约30 min。配制80%乙醇。
2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
3. 根据DNA///片段长度要求,参考表9向上述100 μL DNA上清中加入弟一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。
表9 磁珠文库分选推荐比例
DNA文库插入片段大小 | 150 - 250 bp | 200-300 bp | 300-400 bp |
DNA文库大小 | 230 - 330 bp | 280-380bp | 380-480bp |
第—轮体积比(Beads:DNA) | 0.78× | 0.68× | 0.58× |
第二轮体积比(Beads:DNA) | 0.20× | 0.20× | 0.20× |
【注】:表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为200 bp,样品DNA体积为100 μL,则第—轮分选磁珠使用体积为0.78×100 μL=78 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL;表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA(Post Ligation),如果用户在接头连接前进行分选,请采用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)说明书中推荐的比例。
4. 室温孵育5 min。
5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。
6. 参考表7向上清中加入第二轮分选磁珠。
7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。
8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。
10. 重复步骤9。
11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。
12. 将PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。
13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中。
3.4 文库扩增(Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2.于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。
表10 PCR扩增反应体系
名称 | 体积(μL) |
2×Ultima HF Amplification Mix | 25 |
Primer Mix for MGI | 5 |
Adapter Ligated DNA(3.3步骤产物) | 20 |
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行PCR扩增。
表11 PCR扩增反应程序
温度 | 时间 | 循环数 |
98°C | 1 min | 1 |
98°C | 10 sec | 参照注意事项中表1 |
60°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 5 min | 1 |
4°C | Hold | - |
3.5 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection)
同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。
如需分选,操作方法同3.3.2双轮分选步骤。
3.6文库质量控制
通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。
3.7 文库环化
使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®(Cat#13341)或其他等效产品进行文库单链环化反应。
3.8 参考实例
使用Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®对小牛胸腺gDNA样本进行酶切建库检测,片段化结果见图3;建库结果见图4。
图3 OnePotTM II DNA建库试剂盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA样本(不同酶切时间片段化效果检测)
图4 使用本试剂盒进行human gDNA样本建库,文库进行电泳检测
(Input DNA为50 ng,酶切12 min,扩增8 cycles)
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