OnePot II 酶切法建库试剂盒

13321ES16OnePot II 酶切法建库试剂盒

参考价: 面议

具体成交价以合同协议为准
2022-03-21 14:59:47
979
属性:
供货周期:现货;规格:16 T;货号:13321ES16;应用领域:医疗卫生,生物产业;主要用途:DNA建库;
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产品属性
供货周期
现货
规格
16 T
货号
13321ES16
应用领域
医疗卫生,生物产业
主要用途
DNA建库
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翌圣生物科技(上海)股份有限公司

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产品简介

与传统的建库法比较,本品采用高质量的片段化酶,摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,将片段化模块与末端修复模块合二为一,极大的降低了建库的时间和成本。

详细介绍

产品信息


产品名称

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®

13321ES16

16 T

5363

13321ES96

96 T

26563


产品描述

Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®是针对MGI®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较,本品采用高质量的片段化酶,摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,将片段化模块与末端修复模块合二为一,极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优xiu的文库转化率,可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本,同时能兼容FFPE DNA样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。

Ø 适用10 ng-1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本

Ø 高质量片段化酶,可随机切割双链DNA,酶切片段无偏好性

Ø 片段化、末端修复/加A一步完成

Ø 强扩增效率的高保真酶,显著提高文库质量及产量

Ø 适用于FFPE DNA样本

Ø 严格的批次性能与稳定性质控

产品组分


组分编号与名称

13321ES16

13321ES96

13321-A

图片5.png

Smearase® Mix

160 μL

960μL

13321-B

图片6.png

Ligation Enhancer

480 μL

4×720μL

13321-C

图片6.png

Fast T4 DNA Ligase

80 μL

480μL

13321-D

图片7.png

2×Ultima HF Amplification Mix

400 μL

4×600μL

13321-E

图片7.png

Primer Mix for MGI®

80 μL

480μL

运输与保存方法


冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。

注意事项


一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。


二、关于DNA///片段化


1. 本试剂盒兼容范围为10 ng – 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高质量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中进行片段化。

3. 对于常规的高质量基因组DNA,酶切时间参考表5,本试剂盒片段化偏好低,耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本,酶切时间参考表6。以上为推荐时间,需客户在自己的实验体系中进行微调,以达到蕞佳效果。

4.为保证优质精确的片段化效果,片段化反应配制过程请于冰上操作。

5. 针对FFPE DNA建库,若样本质量不佳,客户对当前建库产量不满意,可选购我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)对FFPE DNA进行修复,具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行,无需额外的操作。


三、关于接头连接(Adapter Ligation)


1. 目前华大智造有2种序号的接头:1-128和501-596。关于其使用要求,请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外,华大智造申明:2种接头由于设计工艺不同,禁止混用,否则测序数据无法拆分!

2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。请按照表1和实际DNA投入量确实确定接头用量,需要稀释接头时,请用TE buffer对接头进行稀释。

表1 10ng-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

Input DNA

10μM Adapter稀释倍数

稀释后投入量(μL)

31ng-1 μg

不稀释

5

10-30 ng

5

5


四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)


1. DNA///片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前,或接头连接后,或文库扩增后进行。

2. 当Input DNA质量≥50 ng,您可选择在接头连接后分选;如Input DNA质量<50 ng,建议您在文库扩增后进行分选。

3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG,会对双轮分选产生显著影响。因此,如在接头连接后进行长度分选,必须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选,可直接进行双轮磁珠分选步骤。

4. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

6. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

8. 进行长度分选时,初始样品体积应尽量≥100 μL,不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

10. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于4°C可保存1-2周,-20°C可保存1个月。


五、关于文库扩增(Library Amplification)


文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒,获得1 μg文库的推荐循环数。

表2  10 ng-1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表

Input DNA(ng)

Number of cycles required to generate

1 μg

1 μg

3 - 5

500 ng

4 - 6

200 ng

5 - 7

50 ng

8 - 10

10 ng

10 - 12

【注】:建库过程中若进行片段分选,扩增时请参照较高循环数扩增。


六、关于文库质检(Library Quality Analysis)


1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR定量的方法。

3. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。

5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

使用方法


一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA Adapter:华大智造或本公司

4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。


二、操作流程

图片1.png

图1 OnePotTM II DNA建库试剂盒操作流程


三、操作步骤

3.1DNA///片段化/末端修复/dA尾添加(DNAFragment/End Preparation/dA-Tailing)

该步骤将基因组DNA///片段化,同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表3中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表3反应体系。

表3  DNA///片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

名称

体积(μL)

Input DNA

x

Smearase® Mix

10

ddH2O

Up to 60 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表4所示反应程序,进行DNA///片段化,末端修复及dA尾添加反应。

表4  DNA///片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

4 °C

1 min*

30 °C

3-20 min**

72 °C

20 min

4 °C

Hold

【注】:*DNA///片段化过程为有效控制片段化效果,避免过度酶切,反应程序可预先设置4°C,待模块温度降至4°C时,将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA,酶切时间参考表5;对于质量不一的FFPE DNA样本,酶切时间参考表6。

图片2.png

图2  Agilent 2200定义不同降解程度样本的DIN值


3.2 接头连接(Adapter Ligation)

该步骤将3.1步骤的产物末端,连接特定的MGI®接头。

1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

3. 于3.1步骤PCR管中配制表7所示反应体系。

名称

体积(μL)

dA-tailed DNA(3.1步骤产物)

60

Ligation Enhancer

30*

Fast T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

5

表7  Adapter Ligation PCR体系

【注】:*Ligation Enhancer比较粘稠,请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表8所示反应程序,进行接头连接反应。

表8  Adapter Ligation PCR反应程序

温度

时间

热盖105°C

Off

20°C

15 min

4°C

Hold

【注】:当Input DNA量较低,实验效果不理想时,可尝试将连接时间延长一倍。

3.3 连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)

该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。

3.3.1 纯化操作步骤:

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取80μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:

1)如产物无需进行片段分选,直接加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠

2)如产物需进行双轮分选,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。

3.3.2 双轮分选操作步骤:

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡约30 min。配制80%乙醇。

2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

3. 根据DNA///片段长度要求,参考表9向上述100 μL DNA上清中加入弟一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。

表9  磁珠文库分选推荐比例

DNA文库插入片段大小

150 - 250 bp

200-300 bp

300-400 bp

DNA文库大小

230 - 330 bp

280-380bp

380-480bp

第—轮体积比(Beads:DNA)

0.78×

0.68×

0.58×

第二轮体积比(Beads:DNA)

0.20×

0.20×

0.20×

【注】:表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为200 bp,样品DNA体积为100 μL,则第—轮分选磁珠使用体积为0.78×100 μL=78 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL;表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA(Post Ligation),如果用户在接头连接前进行分选,请采用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)说明书中推荐的比例。

4. 室温孵育5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。

6. 参考表7向上清中加入第二轮分选磁珠。

7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

10. 重复步骤9。

11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

12. 将PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中。

3.4 文库扩增(Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

2.于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。

表10  PCR扩增反应体系

名称

体积(μL)

2×Ultima HF Amplification Mix

25

Primer Mix for MGI

5

Adapter Ligated DNA(3.3步骤产物)

20

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行PCR扩增。

表11  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

参照注意事项中表1

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

-

3.5 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection)

同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

如需分选,操作方法同3.3.2双轮分选步骤。

3.6文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

3.7 文库环化

使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®(Cat#13341)或其他等效产品进行文库单链环化反应。

3.8 参考实例

使用Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®对小牛胸腺gDNA样本进行酶切建库检测,片段化结果见图3;建库结果见图4。

图片3.png


图3  OnePotTM II DNA建库试剂盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA样本(不同酶切时间片段化效果检测)

图片4.png

图4  使用本试剂盒进行human gDNA样本建库,文库进行电泳检测

(Input DNA为50 ng,酶切12 min,扩增8 cycles)


相关产品


建库试剂盒

产品编号

规格

价格(元)

Hieff  NGS® UltimaTM DNA Library Prep Kit for MGI®

13310ES16/96

16/96 T

4763/ 24563

Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for MGI®

13331ES16/96

16/96 T

4563/22563

Hieff NGS® MaxUpⅡDual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®

12300ES24/96

24/96 T

9853/33853

Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit for Illumina®

12199ES24/96

24/96 T

6783/25563

Hieff NGS® MaxUpⅡDNA Library Prep Kit for Illumina®

12200ES24/96

24/96T

6486/23567

Hieff NGS® OnePotⅡDNA Library Prep Kit for Illumina®

12204ES24/96

24/96 T

7583/28663

Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®

12206ES24/96

24/96 T

6155/23855

文库构建磁珠

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS® cfDNA Clean Beads(100~200 bp)

12599ES08/56

5/60 mL

1666/9106

Hieff NGS® Smarter DNA Clean beads (50 bp以上)

12600ES08/56

5/60 mL

1386/7586

Hieff NGS® DNA Selection Beads(Superior AMPure XP alternative)

12601ES08/56

5/60 mL

986/6286

Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit

12603ES24/96

24/96 T

616/2266

建库接头

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 1

13360ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 2

13361ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 3

13362ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 4

13363ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 5

13364ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 6

13365ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

建库模块

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS® Fast-PaceTM DNA Cyclization Kit for MGI®

13341ES16/96

16/96 T

1853/9253

Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module

12607ES24/96

24/96 T

3263/10863

Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module

12608ES24/96

24/96 T

2066/6166

2×Super Canace® High-Fidelity Mix for Library Amplification

12621ES24/96

24/96 T

583/1783

Hieff NGS® Dual-Mode cDNA Synthesis Kit

12250ES24/96

24/96 T

4885/16485

文库定量

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

12302ES05

500 T

1526

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard (1-6)

12307ES09

6×96 μL

2126

dsDNA HS Assay Kit for Qubit®

12640ES60/76

100/500 T

686/2696

多重PCR定制咨询


HB191112



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