3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2250
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存4周，禁止反复冻融

2. 试剂三：临用前加入2.5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存4周，禁止反复冻融；

3. 试剂四：临用前加入3 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存4周，禁止反复冻融；

4. 试剂五：提供一空棕色试剂瓶。临用前取一支试剂五倒入空瓶中并加入10 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存2周，禁止反复冻融（该试剂为冻干试剂，可能存在肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同）；

5. 工作液的配制：按照蒸馏水：试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=1.14mL：1.5mL：0.06 mL：0.15 mL：0.15 mL：0.6 mL（共3.6mL，4T）的比例配制，根据样本量配制，现用现配。

产品说明：
3-磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate Kinase，PGK，EC.2.7.2.3）是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，引起340nm处的吸光度下降，即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
注意事项：

1. ΔA大于0.8或者A1测定小于0.9时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（10min或15min）或增加样本体积来测定。

2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。

3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

实验实例：

1. 取0.1g白菜加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释4倍，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.126-0.654=0.472，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.916-0.914=0.002，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.472-0.002=0.47，按样本质量计算酶活得：PGK（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.47÷0.1×4=6044.952 U/g 质量。

2. 取0.1g小鼠肌肉加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释20倍，之后按照测定步骤操作，测得计算，ΔA测定管=A1测定-A2测定= 0.908-0.35=0.558，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.916-0.914=0.002，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.558-0.002=0.556，按样本质量计算酶活得：PGK（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.556÷0.1×20=35755. 248 U/g 质量。

3. 取骆驼血清样本100uL按照测定步骤直接测定，测得计算，ΔA测定管=A1测定-A2测定= 0.966-0.907=0.059，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.916-0.914=0.002，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.059-0.002=0.057，按液体体积计算酶活得：PGK（U/mL）=321.54×ΔA=321.54×0.057=18.328 U/mL。

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