双模式RNA 建库试剂盒

13332ES08双模式RNA 建库试剂盒

参考价: 面议

具体成交价以合同协议为准
2022-02-10 10:31:31
1126
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供货周期:现货;规格:8 T;货号:13332ES08;应用领域:生物产业;
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现货
规格
8 T
货号
13332ES08
应用领域
生物产业
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翌圣生物科技(上海)股份有限公司

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产品简介

Hieff NGS® Dual-mode RNA Library Prep Kit for MGI®是用于MGI®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒,包含RNA--pian段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性dscDNA合成试剂,以及文库扩增试剂。

详细介绍

产品信息

 

 

产品描述

Hieff NGS® Dual-mode RNA Library Prep Kit for MGI®是用于MGI®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒,包含RNA--pian段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性dscDNA合成试剂,以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,zui大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

 

产品组分

运输与保存方法

干冰运输。-20保存,效期1年

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

二、关于接头连接(Adapter Ligation)

1. 目前华大智造有2种序号的接头:1-128和501-596。关于其使用要求,请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外,华大智造申明:2种接头由于设计工艺不同,禁止混用,否则测序数据无法拆分!

2. 我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

3. 建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1  Input Total RNA量与接头浓度推荐表*

Input Total RNA

Adapter stock concentration

100–499 ng

2 μM

500–4000 ng

5 μM

*可根据不同类型total RNA样本及投入量,按需求适当调整Adapter使用量

三、关于文库扩增(Library Amplification )

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第—代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

表2  Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA

Number of cycles

Non-stranded

Stranded

100 ng

12-14

14-16

1000 ng

10-12

12-14

≥2000 ng

8-10

10-12

【注】:*由于不同物种和组织所提取的Total RNA中,mRNA的含量差异较大。实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

四、DNA磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检(Library Quality Analysis)

1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

六、自备材料(Other Material)

1. mRNA富集试剂盒:Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit(Yeasen Cat#12603)。 

2. rRNA去除试剂盒:Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)。

3. RNA纯化磁珠: Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。

4. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads(A63880)或其他等效产品。

5. RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

6. Adapters:详情请咨询华大智造或本公司

7. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

8. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

建库流程图

 

 

图1 RNA建库操作流程

 

使用方法

Part 1:目标RNA的富集和片段化

该步骤是建库前的目标RNA制备,根据建库需求可选择Poly(A) mRNA Isolation方案(方案A)或rRNA Depletion方案(方案B)。Yeasen Cat#13332建库模块不包含该步骤所用试剂,请客户根据建库需要自备相应的试剂。

方案A:mRNA纯化和片段化(mRNA Purification and Fragmentation)

样本要求

该方案使用Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit(Yeasen Cat#12603)进行mRNA富集。适用于起始模板量为0.1-4 μg(体积≤50 μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低,体积超过50 μL,可使用Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat#12602)磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的RNA,如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A)尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。

操作步骤

1. 将mRNA Capture Beads从2-8取出,静置使其温度平衡至室温,约30 min。

2. 准备一个Nuclease free离心管,取0.1-4 μg总RNA,用Nuclease free水将体积补至50 μL,冰上放置备用。

3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。

4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,65,5 min;4,hold,使得RNA变性。

5. 室温孵育5 min,使mRNA与磁珠*结合。

6. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。

7. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以*混匀。将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

8. 重复步骤7,共洗涤两次。

9. 将样品从磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以*混匀。

10. 将样品置于PCR仪中,80,2 min;25,hold,将mRNA洗脱下来。

11. 将样品从PCR仪中取出,加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反复吹打6次以*混匀。

12. 室温放置5 min,使mRNA结合到磁珠上。

13. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

14. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以*混匀,将样品重新放回至磁力架中,室温静置5 min,吸掉全部上清。

【注】:后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

15. 将样品从磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以*混匀;将样品置于PCR仪中(预设为94℃或85℃),可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化时间的梯度,比如94℃,5 min或85℃,6 min。使用Agilent 2100分析双链cDNA纯化产物大小。

表3 mRNA--pian段化程序推荐

插入片段大小(bp)

打断程序

150-200

94°C,6 min;

200-300

94°C,5 min;

250-450

85°C,8 min;

400-550

85°C,6 min;

16. 片段化程序结束后,为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合,请立即将样品置于磁力架中,待溶液澄清后,转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中,立刻进入第—链合成反应(Part 2-Step 1)

方案B:rRNA去除与RNA--pian段化(rRNA Depletion and RNA Fragmentation)

样本要求

该方案使用Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)去除Total RNA 中的rRNA。适用于人、小鼠、大鼠来源的 100 ng~1 μg (体积≤ 11 μL)总RNA 样品;适用于完整或部分降解 RNA(如 FFPE RNA)样品。

操作步骤

Step 1 探针杂交

1. 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出,解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 准备RNA样品:根据投入量和样品浓度,计算RNA取样体积,用Nuclease free H2O稀释至11 μL。

3. 按照表4于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表 4 探针杂交反应体系

名称

体积(μL)

Hybridization Buffer

3

Probe Mix(H/M/R)

1

Total RNA

11(100 ng~1 μg)

Total

15

4. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

5. 将上述 PCR 管置于PCR仪(可设置梯度降温)中,按照表5所示反应程序,进行探针杂交反应。

 

表5 探针杂交反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

95

2 min

95-22

0.1/s

22

5 min

4

hold

Step 2  RNase H消化

1.将RNase H消化试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。按照表 6 所示,配制RNase H消化反应体系。

表6 RNase H消化反应体系

名称

体积(μL)

RNase H Buffer

3

RNase H

2

上步产物

15

Total

20

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中,设置反应程序:37,30 min; 4,hold,进行RNase H消化反应。

Step 3  DNase I 消化

1. 将DNase I消化试剂从-20 °C 取出,解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。按照表7所示,配制DNase I消化反应体系。

表7 DNase I消化反应体系

名称

体积(μL)

DNase I Buffer

27.5

DNase I

2.5

上一步产物

20

Total

50

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中,设置反应程序:37,30min; 4,hold,进行DNase I消化反应。

Step 4  RNA纯化

1. 准备工作:将 Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat#12602)磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少 30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取 110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner(2.2×,Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中,移液器充分吹打混匀,室温孵育 5 min。

4. 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育 30 sec 后,小心移除上清。

6. 重复步骤 5,总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

7. 保持 PCR 管始终置于磁力架中,室温下开盖干燥磁珠(5~10 min)。

8. RNA洗脱:将PCR 管从磁力架上取下,加入18.5 μL Frag/Prime buffer,使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置 5 min。

9. 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取 17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中,进行RNA- pian段化。

10. RNA--pian段化条件需根据样本质量进行调整,高质量的RNA样本,片段化条件可参考mRNA--pian段化条件(表3)。表8推荐了FFPE不同质量样本的片段化条件。但不同的样本片段化效果会存在一定的差异,客户可根据自己的样本情况,做不同片段化条件对比,选择合适的片段化条件。

11. 片段化结束请立即置于冰上,进入一链合成反应(Part 2-Step 1)

 

表8 FFPE RNA--pian段化条件推荐

DV200*

片段化程序

>70%

85°C,7 min;

50%~70%

85°C,5 min;

20%~50%

85°C,3 min;

<20%(风险建库)

85°C,3 min或65°C,5 min

*降解RNA的样本质量使用DV200指标判断,详见附录二说明

Part 2:RNA文库构建

Step 1 第—链cDNA的合成(1st Strand Synthesis)

该步骤将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。目标RNA的富集可根据实验需求和样本情况选择Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案,详见Part 1。

1. 将第—链合成试剂从-20°C取出,颠倒混匀后瞬离。按表9所示,配制第—链cDNA合成的反应液

表9 第—链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL)

Frag/Prime Buffer with Fragmented RNA

17

Strand Specificity Reagent

6

1st Strand Enzyme Mix

2

Total

25

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表10所示设置反应程序,进行第—链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表10 第—链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105°C

On

25°C

10 min

42°C

15 min

70°C

15 min

4°C

Hold

Step 2第二链cDNA的合成/末端修复/加A(2nd Strand Synthesis/dA-Tailing):

1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表11所示,配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表11 第二链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL)

1st Strand cDNA

25

2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)*

30

2nd Strand Enzyme Master Mix

5

Total

60

【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTP的buffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTP的buffer。

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表12所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。

表12 第二链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105°C

on

16°C

30 min

72°C

15 min

4°C

Hold

Step 3 接头连接(Adapter Ligation)

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的MGI®接头。

1. 参考注意事项二中的表1,根据Input RNA量,稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表13中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表13所示反应体系。

表13 Adapter Ligation体系

名称

体积(μL)

dA-tailed DNA

60

Ligation Enhancer

30*

Fast T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

5**

【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

**请根据注意事项三中表1的提示,用0.1×TE buffer对接头进行稀释,接头体积固定为5 μL

4. 使用移液器轻轻吹打混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表14所示反应程序,进行接头连接反应:

表14 Adapter Ligation反应程序

温度

时间

热盖

Off

20°C

15 min

4°C

Hold

Step4连接产物纯化和片段大小分选(Post Ligation Clean Up and Size Selection)

目前有两个方案应用于该步骤,当插入片段<200 bp时,使用方案A,通过两次纯化去除体系中的接头残留;当插入片段≥200 bp时,使用方案B,通过纯化、分选获得目标长度的文库。

方案A:适用于插入片段<200 bp的文库(需进行两轮纯化)

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入52 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取50 μL上清至新PCR管中,再进行一轮纯化。

9. 吸取40 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至上一步产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。

11. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

12. 重复步骤11,总计漂洗两次。

13. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

14. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。

方案B:适用于插入片段大于200 bp的文库(先纯化,再分选)

方案B-1:接头连接产物的纯化

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。

【注】:Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响,所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

方案B-2:双轮分选

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA--pian段长度要求,参考表15,在上述100 μL DNA中加入第—轮分选磁珠,涡旋或移液器吹打10次混匀。

表15文库分选推荐磁珠比例

DNA文库插入片段大小(峰值,bp)

~ 200

~ 300

~ 400

~ 500

打断条件

94℃,5 min

85℃,8 min

85℃,8 min

85℃,6 min

  接头连接之后分选或文库扩增之后分选

第—轮体积比

0.78×

0.68×

0.58×

0.48×

第二轮体积比

0.20×

0.20×

0.20×

0.20×

【注】:此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure® XP磁珠和Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为200 bp时,若在接头连接之后分选,样品DNA体积为100 μL,则第—轮分选磁珠使用体积为0.78×100 μL=78 μL,第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL。

3. 室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2 μL溶液于管底。

5. 参考表15向上清中加入第二轮分选磁珠。

6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。

8. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

9. 重复步骤8。

10. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3 min)。

11. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约3 min),小心转移20 μL上清至干净管中。

Step 5 文库扩增(Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表16中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用

2. 于无菌PCR管中配制表16所示反应体系。

表16 接头连接产物PCR反应体系

组分名称

体积(μL)

2×Ultima HF Amplification Mix

25

Primer Mix for MGI®

5

Adapter Ligated DNA

20

 

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表17示反应程序,进行PCR扩增

表17  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

10~17cycles*

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

-

*文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整,详见注意事项三。

Step 6 扩增产物磁珠纯化(Post Amplification Clean Up)

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行文库定量、质检。

Step 7 文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项五。

 

Step 8 文库环化

使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®(Cat#13341)或其他等效产品进行文库单链环化反应。

 

附录一:mRNA--pian段化效果展示

 

图2. mRNA不同打断时间对应的双链cDNA--pian段范围。取1 μg Universal Human Reference RNA,经mRNA提取试剂盒提取后,分别以94°C,6 min、85℃,8 min和85℃,5 min处理。打断后mRNA进行双连cDNA的合成,经过1.8×磁珠回收后,通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

【注】:本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA,若使用其他来源的RNA,优化打断时间。

附录二:FFPE样本建库说明

1. FFPE RNA质量评价

rRNA去除建库方案可用于FFPE等低质量的 Total RNA 样本,但由于不同FFPE样本的质量差距较大,需要根据样本情况调整建库条件。常规评价 RNA 样本质量的参数是 RIN 值,但是对于 FFPE 这种降解的样本,并不能*用 RIN 值来准确衡量样本的质量,此时还需要用到 DV200指标。DV200 表示样本中大于 200nt的 RNA 片段所占的比例,对于降解严重的 FFPE 样本,DV200值能够更好的反应样本的质量。

DV200计算方法如下:

 

在一个检测完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 结果图中,在 Local 下选择 Advanced

勾选 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 选项

选择Region Table页面,鼠标右击,选择Add Region

调整指示线的范围即可得到所选片段范围 所占的比例 % of Total

2. FFPE RNA建库示例

下表展示了不同质量FFPE样本在不同建库条件下的文库分布,以供参考。对于降解严重的FFPE RNA(DV200<50%)和起始量低的文库构建,我们推荐接头连接后采用两次纯化方案,以减少文库损失。

RNA样本质控

建库条件

文库分布质控

 

RIN=2.2; DV200=74%

 

投入量:1 μg

片段化条件:85℃,7 min

接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8×

链特异建库扩增:14cycles

文库产量:1283 ng

 

投入量:1 μg

片段化条件:85℃,7 min

接头连接后进行纯化/分选:0.6×;062×/0.15×

链特异建库扩增:14cycles

文库产量:776 ng

 

投入量:100 ng

片段化条件:85℃,7 min

接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8×

链特异建库扩增:17cycles

文库产量:849 ng

 

 

RIN=2.4; DV200=40%

投入量:500 ng

片段化条件:85℃,3 min

接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8×

链特异建库扩增:15cycles

文库产量:308 ng

 

投入量:500 ng

片段化条件:85℃,3 min

接头连接后进行纯化、分选:0.6×;0.74×/0.15×

链特异建库扩增:15cycles

文库产量:135 ng

 

投入量:100 ng

片段化条件:85℃,3 min

接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8×

链特异建库扩增:17cycles

文库产量:68 ng

 

 

RIN=2.5; DV200=18%

投入量:1 μg

片段化条件:85℃,3 min

接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8×

链特异建库扩增:14cycles

文库产量:264 ng

 

 

RIN=2.5; DV200=19%

投入量:100 ng

片段化条件:65℃,5 min

接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8×

链特异建库扩增:17cycles

文库产量:22 ng

 

 

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建库试剂盒

产品编号

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文库构建磁珠

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Hieff NGS® DNA Selection BeadsSuperior AMPure XP alternative

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5/60 mL

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24/96 T

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建库接头

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规格

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Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 1

13360ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 2

13361ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 3

13362ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 4

13363ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 5

13364ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for MGI, Set 6

13365ES04/16/96

16×4/×16/×100 T

1153/3653/15653

建库模块

产品编号

规格

价格(元)

Hieff NGS® Fast-PaceTM DNA Cyclization Kit for MGI®

13341ES16/96

16/96 T

1853/9253

Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module

12607ES24/96

24/96 T

3263/10863

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12608ES24/96

24/96 T

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12621ES24/96

24/96 T

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24/96 T

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100/500 T

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HB200210

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