产品信息

产品描述

Hieff NGS^® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina^®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒，包含RNA---片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

运输与保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

注意事项

一、 关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

二、关于接头连接（Adapter Ligation）

1. 本公司可提供长接头（Indexed Adapter）试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12414~Cat#12415）。

2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM，接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表

三、关于文库扩增（Library Amplification ）

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真 DNA 聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2. 如果您使用 Indexed Adapter（也称为长接头、大 Y 接头），可使用本试剂盒提供的引物 Primer mix 进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小 Y 接头”，则需要使用 Index Primers 进行扩增，加上相应的 Index。

3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表 2 列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。

4. 表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

四、DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

六、自备材料（Other Material）

1. mRNA富集试剂盒：Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit（Yeasen Cat#12603）。

2. rRNA去除试剂盒：Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)。

3. RNA纯化磁珠： Hieff NGS^® RNA Cleaner（Yeasen Cat#12602）或其他等效产品。

4. DNA纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效产品。

5. RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

6. Adapters：含Index的长接头（Yeasen Cat#12615~12618）或者无Index的短接头试剂盒（Yeasen Cat#12414-12415）。

7. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

8. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

建库流程图

图1 RNA建库操作流程

使用方法

Part 1：目标RNA的富集和片段化

该步骤是建库前的目标RNA制备，根据建库需求可选择Poly(A) mRNA Isolation方案（方案A）或rRNA Depletion方案（方案B）。Yeasen Cat#12252建库模块不包含该步骤所用试剂，请客户根据建库需要自备相应的试剂。

方案A：mRNA纯化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）

样本要求

该方案使用Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit（Yeasen Cat#12603）进行mRNA富集。适用于起始模板量为10 ng-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS^® RNA Cleaner（Yeasen Cat#12602）磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。

操作步骤

1. 将mRNA Capture Beads从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。

2. 准备一个Nuclease free离心管，取10 ng-4 μg总RNA，用Nuclease Free水将体积补至50 μL，冰上放置备用。

3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。

4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5 min；25℃，5 min；25℃，hold，完成RNA与捕获磁珠的结合。

5. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。

6. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以*混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

7. 重复步骤6，共洗涤两次。

8. 将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以*混匀。

9. 将样品置于PCR仪中，80℃，2 min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。

10. 将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反复吹打6次以*混匀。

11. 室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。

12. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

13. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以*混匀，将样品重新放回

至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。

【注】：最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

提前准备1× Frag/Prime Buffer（用Nuclease Free H₂O等体积混匀配置，如配置一个反应体系：9.5 μL 2×Frag/Prime Buffer + 9.5 μL Nuclease Free H₂O）

14. 将样品从磁力架上取出，用19 μL Frag/Prime Buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以*混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94℃），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如94℃，5 min。使用Agilent 2100分析mRNA纯化产物大小。

表3 mRNA---片段化程序推荐

15. 片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17 μL上清至一个新的Nuclease Free离心管中，立刻进入第一链合成反应（Part 2-Step 1）。

方案B：rRNA去除与RNA---片段化（rRNA Depletion and RNA Fragmentation）

样本要求

该方案使用Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)去除Total RNA 中的rRNA。适用于人、小鼠、大鼠来源的 1 ng~1 μg （体积≤ 11 μL）总RNA 样品；适用于完整或部分降解 RNA（如 FFPE RNA）样品。

操作步骤

Step 1 探针杂交

1. 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease Free H₂O稀释至11 μL。

3. 按照表4于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表 4 探针杂交反应体系

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

5. 将上述 PCR 管置于PCR仪（可设置梯度降温）中，按照表5所示反应程序，进行探针杂交反应。

表5 探针杂交反应程序

Step 2  RNase H消化

1.将RNase H消化试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表 6 所示，配制RNase H消化反应体系。

表6 RNase H消化反应体系

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50℃；37°C，30 min； 4°C，hold，进行RNase H消化反应。

Step 3 DNase I 消化

1. 将DNase I消化试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表7所示，配制DNase I消化反应体系。

表7 DNase I消化反应体系

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50℃；37℃，30min； 4℃，hold，进行DNase I消化反应。

Step 4 RNA纯化

1. 准备工作：将 Hieff NGS^® RNA Cleaner（Yeasen Cat#12602）磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease Free H₂O配制 80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取 110 μL Hieff NGS^® RNA Cleaner（2.2×，Beads:DNA=2.2:1）至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。

4. 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6. 重复步骤 5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

7. 保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5~10 min）。

【注】：提前准备1× Frag/Prime Buffer（用Nuclease Free H₂O等体积混匀配置，如配置一个反应体系：9.5 μL 2×Frag/Prime Buffer + 9.5 μL Nuclease Free H₂O）

8. RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入19 μL Frag/Prime buffer，使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。

9. 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取 17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中，进行RNA---片段化。

10. RNA---片段化条件需根据样本质量进行调整，高质量的RNA样本，片段化条件可参考mRNA---片段化条件（表3）。表8推荐了FFPE不同质量样本的片段化条件。但不同的样本片段化效果会存在一定的差异，客户可根据自己的样本情况，做不同片段化条件对比，选择合适的片段化条件。

11. 片段化结束请立即置于冰上，进入一链合成反应（Part 2-Step 1）。

表8 FFPE RNA---片段化条件推荐

*降解RNA的样本质量使用DV₂₀₀指标判断，详见附录三说明

Part 2：RNA文库构建

Step 1 第一链cDNA的合成（1^st Strand Synthesis）

该步骤将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。目标RNA的富集可根据实验需求和样本情况选择Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案，详见Part 1。

1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表9所示，配制第一链cDNA合成的反应液。

表9 第一链cDNA合成反应体系

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表10所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表10 第一链cDNA合成反应程序

Step 2第二链cDNA的合成/末端修复/加A（2^nd Strand Synthesis/dA-Tailing）：

1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表11所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表11 第二链cDNA合成反应体系

【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的Buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的Buffer。

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表12所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表12 第二链cDNA合成反应程序

Step 3 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina^®接头。

1. 参考注意事项二中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表13中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表13所示反应体系。

表13 Adapter Ligation体系

【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表14所示反应程序，进行接头连接反应：

表14 Adapter Ligation反应程序

Step4连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）

本方案适用于片段＜200 bp时，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片段≥200 bp时，参照附录二的分选方案，通过纯化、分选获得目标长度的文库。

适用于插入片段<200 bp的文库（需进行两轮纯化）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入52 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。

9. 吸取40 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

11. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

12. 重复步骤11，总计漂洗两次。

13. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

14. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

Step 5 文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表15中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表15所示反应体系。

表15-A  短接头连接产物PCR反应体系                                                             表15-B  长接头连接产物PCR反应体系

【注】：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂（Cat#12414-12415）中配备的Index primer进行扩增。**如果您使用的是Indexed Adapter（Cat#12615~ Cat#12618），俗称长接头（大Y接头），可用试剂盒中的Primer Mix进行扩增；

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表16示反应程序，进行PCR扩增。

表16  PCR扩增反应程序

Step 6 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

Step 7 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

附录一：mRNA---片段化效果展示

图2. mRNA不同打断时间对应的RNA---片段范围。分别以94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min处理。打断后mRNA进行进行2.2X 磁珠纯化，通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。

附录二：分选条件说明

分选方案适用于94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化的RNA建库，可以获得插入片段大于200bp的文库：方案一：接头连接产物纯化后分选

0.6X Hieff NGS^® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。

【注】：Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响，所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

双轮分选（以94°C，7min打断，分选文库大小为410bp~510bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）

当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12414-12415）进行RNA建库时，分选比例参照表17进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）进行连接后纯化，分选比例参照表18进行。

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA---片段长度要求，参考表17，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL(0.65×），涡旋或移液器吹打10次混匀。

【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL；若在长接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。

3. 室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液管底。

5. 参考表17向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL(0.15×）。

6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

8. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

9. 重复步骤8。

10. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

11. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表17 短接头文库分选推荐磁珠比例

表18 长接头文库分选推荐磁珠比例

图3. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根据表17推荐的磁珠比例得到的文库大小。

方案二：接头连接产物直接分选（以94°C，7min打断，分选文库大小为410bp~510bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）

500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库，推荐直接分选，体系比较粘稠，需要小心添加，RNA质量略差样本可能会有接头残留。

当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12414-12415）进行RNA建库时，分选比例参照表19进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）进行连接后纯化，分选比例参照表20进行。

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA---片段长度要求，参考表19，在上述100 μL的连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL(0.20×），涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移 100 μL上清到干净的离心管中，。

4. 参考表19向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL(0.10×）。

5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min。

6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重复步骤7。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

10. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表19 短接头文库分选推荐磁珠比例

表20 长接头文库分选推荐磁珠比例

图4. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根据表19推荐的磁珠比例得到的文库大小。

附录三：FFPE样本建库说明

1. FFPE RNA质量评价

rRNA去除建库方案可用于FFPE等低质量的 Total RNA 样本，但由于不同FFPE样本的质量差距较大，需要根据样本情况调整建库条件。常规评价 RNA 样本质量的参数是 RIN 值，但是对于 FFPE 这种降解的样本，并不能*用 RIN 值来准确衡量样本的质量，此时还需要用到 DV₂₀₀指标。DV₂₀₀ 表示样本中大于 200nt的 RNA 片段所占的比例，对于降解严重的 FFPE 样本，DV₂₀₀值能够更好的反应样本的质量。

DV₂₀₀计算方法如下：

① 在一个检测完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 结果图中，在 Local 下选择 Advanced

② 勾选 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 选项

③ 选择Region Table页面，鼠标右击，选择Add Region

④ 调整指示线的范围即可得到所选片段范围 所占的比例 % of Total

2. FFPE RNA建库示例

下表展示了不同质量FFPE样本在不同建库条件下的文库分布，以供参考。对于降解严重的FFPE RNA（DV₂₀₀<50%）和起始量低的文库构建，我们推荐接头连接后采用两次纯化方案，以减少文库损失。