Yeasen/翌圣生物 品牌
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Hieff NGS™ DNA分选磁珠
面议Hieff NGS® Ultima Pro PCR Free DNA Library Pr
¥2475Hieff NGSTM mRNA Isolation Master Kit
面议phi29 DNA Polymerase (10 U/μL)
¥585Recombinant Ten-Eleven Translocase
¥1555Recombinant Ten-Eleven Translocase (TET)14
¥1555Recombinant APOBEC3A (A3A) Protein
¥13354×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen
¥725Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profili
¥2855Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polym
¥3015E. coli DNA ligase (60 U/μL)
¥554× Frag/Prime Buffer
¥102产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格/元 |
Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina® Illumina平台极速RNA建库试剂盒 | 12304ES08 | 8 T | 4875.00 |
12304ES24 | 24 T | 12675.00 | |
12304ES96 | 96 T | 42875.00 |
产品描述
Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®是用于Illumina®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒,包含宿主(人)rRNA去除试剂,RNA反转录试剂,常规ds-cDNA合成试剂,转座酶和优化的缓冲体系,以及文库扩增试剂。本产品利用专业开发设计的新一代转座酶可以完成5~10 ng ds-cDNA建库,简化了操作流程,将建库时间缩短到3 h。本试剂盒具有优秀的文库转化率,可应用于多种临床样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品组分
组分编号和名称 | 12304ES08 | 12304ES24 | 12304ES96 | ||
12304-A | Random Primer & rRNA Removal Mix | 16 μL | 48 μL | 192 μL | |
12304-B | 1st Reaction Buffer | 64 μL | 192 μL | 768 μL | |
12304-C | 1st Strand Enzyme Mix | 16 μL | 48 μL | 192 μL | |
12304-D | 2nd Reaction Buffer | 56 μL | 168 μL | 672 μL | |
12304-E | 2nd Strand Enzyme Mix | 24 μL | 72 μL | 288 μL | |
12304-F | 5×Reaction Buffer | 32 μL | 96 μL | 384 μL | |
12304-G | Transposome Mix V1 | 40 μL | 120 μL | 480 μL | |
12304-H | PCR Primer Mix | 24 μL | 72 μL | 288 μL | |
12304-I | 2×Ultima Amplification Mix | 200 μL | 600 μL | 2×1200 μL | |
12304-J | N5 (N501)* | 8 μL | —— | —— | |
12304-K | N7 (N701)* | 4 μL | —— | —— | |
12304-L | N7 (N702)* | 4 μL | —— | —— |
运输与保存方法
干冰运输。-20℃保存。有效期1年。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。
6. 本产品仅作科研用途!
二、关于产品原理
本产品基于转座酶法开发,其核心原理是转座酶及其转座机制。在 Transposome Mix 中包含由转座酶和两种等摩尔的接头Adapter 1和Adapter 2构成一个完整的转座子。转座发生时,该转座子将 Adapter 1 和 Adapter 2 接头序列插入靶基因中,形成一端带有Adapter 1,一端带有 Adapter 2 的 DNA,之后利用DNA聚合酶将转座形成的切口补齐。这种产物经 N5 (N5XX)和N7 (N7XX)以及 P5 和 P7 (PCR Primer Mix)两对引物扩增,产物经分选和纯化后即为可测序文库。
图1 Transposome的工作原理
三、关于ds-cDNA的片段化
1. 本试剂盒适用5~10 ng Input ds-cDNA。在 Input ds-cDNA 投入前,使用基于双链 DNA 荧光染料的方法,如 Qubit® ,PicoGreen®等进行定量。【注:Transposome Mix 对 DNA 浓度非常敏感,所以准确的 DNA 浓度测定对实验成功与否至关重要。】
四、DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。
五、关于文库质检 (Library Quality Analysis)
1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。
3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。
5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
六、自备材料 (Other Material)
1. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。
2. N5 (N5XX)和N7 (N7XX) Index引物:Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index) (Cat#12610ES96)。
3. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。
4. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
建库流程
图2 极速 RNA建库操作流程
使用方法
Step 1 宿主rRNA的去除
1. 将 Random Primer & rRNA Removal Mix室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。按照下表配置反应液:
表1 宿主rRNA去除反应体系
名称 | 体积 (μL) |
Random Primer & rRNA Removal Mix | 2 |
RNA (10 ng~500 ng) | 13 |
Total | 15 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表2所示设置反应程序,进行RNA的预变性。
表2 宿主rRNA去除反应程序
温度 | 时间 |
热盖 105°C | On |
85°C | 5 min |
72°C | 2 min |
60°C | 10 min |
立即置于冰上 | 3 min |
Step 2 第一链cDNA的合成 (1st Strand Synthesis)
1. 将第一链合成试剂从-20°C取出,室温解冻,颠倒混匀后瞬离。按表6所示,配制第一链cDNA合成的反应液。
表3 第一链cDNA合成反应体系
名称 | 体积 (μL) |
变性的RNA | 15 |
1st Reaction Buffer | 8 |
1st Strand Enzyme Mix | 2 |
Total | 25 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表4所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
表4第一链cDNA合成反应程序
温度 | 时间 |
热盖 105°C | On |
25°C | 5 min |
42°C | 30 min |
85°C | 5 min |
4°C | Hold |
Step 3第二链cDNA的合成 (2nd Strand Synthesis):
1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表5所示,配制第二链cDNA合成反应液。
表5 第二链cDNA合成反应体系
名称 | 体积 (μL) |
1st Strand cDNA | 25 |
2nd Reaction Buffer | 7 |
2nd Strand Enzyme Mix | 3 |
Total | 35 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表6所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。
表6 第二链cDNA合成反应程序
温度 | 时间 |
热盖 | Off |
16°C | 30 min |
4°C | Hold |
Step4 cDNA产物纯化 (Post Ligation Clean Up)
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取21 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至第二链cDNA产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入14 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取12 μL上清至新PCR管中,取1 μL的纯化测第二链cDNA产物进行Qubit 定量,进行转座酶的片段化。
Step 5 DNA段化 (DNA Tagment)
1. 准备工作:将 Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。将5×Reaction Buffer 室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌 PCR 管中配制表 7 所示反应体系。
表7 片段化反应体系
名称 | 体积 (μL) |
2nd Strand cDNA纯化产物 | 5~10 ng |
5×Reaction Buffer | 4 |
Transposome Mix V1 | 5 |
ddH2O | Up to 20 |
3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表8所示反应程序,进行DNA段化,末端修复及dA尾添加反应。
表8 片段化的反应程序
温度 | 时间 |
热盖105°C | on |
55°C | 10 min |
4°C | Hold |
Step 6 文库扩增 (Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表8中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表9所示反应体系。
表9 文库扩增PCR反应体系
组分名称 | 体积 (μL) |
片段化产物 | 20 |
PCR Primer Mix | 3 |
N5XX* | 1 |
N7XX* | 1 |
2×Ultima Amplification Mix | 25 |
Total | 50 |
【注】:*Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)(Cat#12610ES96)中提供8种N5XX和12种N7XX,可根据样品数量和Index选择策略自行选择。
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表10示反应程序,进行PCR扩增。
表10 文库扩增PCR扩增反应程序
温度 | 时间 | 循环数 |
72°C | 3 min | 1* |
95°C | 1 min | 1 |
95°C | 10 sec | 13~15 cycles** |
55°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 1 min | 1 |
4°C | Hold | - |
【注】:*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链 DNA,72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。
**循环数请根据测序需要进行选择。起始 DNA 量为 5-10 ng 时,推荐 13-15 个扩增循环。
Step 7 扩增产物磁珠纯化 (Post Amplification Clean Up)
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至PCR产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行文库定量、质检。
Step 8 文库质量控制
通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项五。
使用Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®对50 ng ~500 ng 293 RNA样本建库,使用0.9×磁珠进行PCR后纯化,结果使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。
图3 极速 RNA建库峰图
HB220117